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Biomarcadores asociados al TEA: fiabilidad de la prueba y relación con la variación de rasgo social




POR OZGE OZTAN, CATHERINE F. TALBOT, EMANUELA ARGILLI, ALYSSA C. MANESS, SIERRA M. SIMMONS, NOREEN MOHSIN, LAURA A. DEL ROSSO, JOSEPH P. GARNER, ELLIOTT H. SHERR, JOHN P. CAPITANIO Y KAREN J. PARKER

Fuente: Molecular Autism | 08/07/2021

Fotografía: Pixabay


Molecular Autism volumen 12, número de artículo: 50 (2021)


Biomarcadores asociados al autismo: fiabilidad de la prueba y relación con la variación de rasgos sociales cuantitativos en monos Rhesus


Resumen


Antecedentes


Los monos Rhesus (Macaca mulatta) presentan pronunciadas diferencias individuales en los rasgos sociales, según la medición de la Escala de Sensibilidad Social de los macacos-Revisada. La Escala de Sensibilidad Social de los macacos se adaptó previamente de la Escala de Sensibilidad Social, un instrumento diseñado para evaluar la variación de los rasgos sociales y autistas en los seres humanos.

Para comprender mejor los posibles fundamentos biológicos de esta variación conductual, evaluamos la consistencia de rasgos de varias medidas biológicas previamente implicadas en el autismo (por ejemplo, arginina vasopresina, oxitocina y sus receptores, así como ERK1/2, PTEN y AKT(1-3) de las vías RAS-MAPK y PI3K-AKT). También comprobamos qué medidas biológicas predecían las puntuaciones de la Escala de Sensibilidad Social Revisada de los macacos.



Métodos


Se recogieron muestras de líquido cefalorraquídeo y de sangre de N = 76 monos machos que, como muestra, mostraron una distribución continua en la Escala de Sensibilidad Social de los macacos-Revisada. En un subconjunto de estos sujetos (n = 43), las muestras se recogieron tres veces durante un período de 10 meses. Se utilizaron las siguientes pruebas estadísticas: Coeficientes de correlación intraclase "Caso 2A" de consistencia, análisis de componentes principales y modelización lineal general.



Resultados


Todas las medidas biológicas (excepto la AKT) mostraron una significativa fiabilidad de prueba-retest dentro de los individuos a través de los puntos de tiempo. A continuación, realizamos un análisis de componentes principales sobre los datos de los monos con conjuntos completos de medidas biológicas en el primer punto temporal (n = 57), para explorar posibles correlaciones entre las medidas biológicas fiables y su relación con la puntuación de la Escala de Sensibilidad Social Revisada de los macacos; se encontró una solución de tres componentes. Los análisis de seguimiento revelaron que la concentración de arginina vasopresina en el líquido cefalorraquídeo, pero ninguna otra medida biológica, predijo de forma sólida las diferencias individuales en las puntuaciones de la Escala de Respuesta Social Revisada de los macacos, de forma que los monos con la menor concentración de arginina vasopresina en el líquido cefalorraquídeo mostraron el mayor deterioro social. Por último, confirmamos que este resultado se mantuvo en la muestra más amplia del estudio (en la que se disponía de los valores de arginina vasopresina en líquido cefalorraquídeo de n = 75 de los sujetos).



Conclusiones


Estos resultados indican que la concentración de arginina vasopresina en el líquido cefalorraquídeo es una medida estable de tipo rasgo y que está vinculada a la variación cuantitativa de rasgos sociales en los monos rhesus macho.



Antecedentes


Todas las especies de primates son sociales durante al menos una parte de su vida [1]. La sociabilidad requiere la capacidad de reconocer y recordar a sus congéneres, comunicar información de manera efectiva, interactuar de una manera típica de la especie, y adquirir y utilizar el conocimiento sobre las relaciones sociales que existen entre los miembros de su grupo social [2]. Sin embargo, en las especies de primates no humanos son evidentes las pronunciadas variaciones individuales en el funcionamiento social [3, 4]. Aunque esta variación social ha sido bien documentada, no ha sido estudiada sistemáticamente [5].


La introducción de la Escala de Sensibilidad Social (SRS) facilitó la evaluación rápida y a gran escala de la variación de los rasgos sociales en los seres humanos [6, 7]. Esta escala proporciona una medida cuantitativa del funcionamiento social típico y atípico en entornos sociales naturales [8, 9]. Esta escala se puntúa de forma que las puntuaciones más altas del SRS indican un mayor deterioro social. Se ha demostrado que las puntuaciones del SRS se distribuyen de forma continua en la población humana general [10]. En el extremo de la distribución de la población, las puntuaciones más altas del SRS se solapan significativamente con un diagnóstico de trastorno del espectro autista (TEA) [8, 11], un trastorno cerebral caracterizado por déficits cognitivos y de interacción social básicos [12]. Esta evidencia colectiva ha permitido el uso del SRS como herramienta de investigación para medir la presencia de rasgos autistas en miembros de la población humana general [7, 13], y como herramienta de cribado clínico para el TEA [8, 9].


El SRS ha demostrado ser una medida útil de la variación social en múltiples y diversas sociedades humanas [14,15,16,17]. Dada su amplia aplicabilidad en humanos, el SRS ha sido adaptado para su uso en chimpancés [18, 19] y macacos rhesus [20] para permitir la evaluación de la presencia de rasgos sociales similares en estas especies. En consonancia con la puntuación total del SRS humano [10], las puntuaciones del SRS de los chimpancés y del SRS de los macacos (mSRS) se distribuyen de forma continua en sus respectivas poblaciones generales [18,19,20,21]. Además, los monos rhesus observados con 1,5 desviaciones estándar (SD) por encima de la media de la población en el comportamiento no social que se produce de forma natural también se clasifican como con una mayor carga de rasgos similares al autismo [21].


Actualmente se sabe muy poco sobre los fundamentos biológicos de la variación cuantitativa de los rasgos sociales en primates humanos y no humanos. Esto se debe a que las investigaciones biológicas previas se han centrado típicamente en el desarrollo del comportamiento social típico de la especie (por ejemplo, el inicio del comportamiento parental; la formación del vínculo social) en especies de roedores [22]. Sin embargo, varias vías de señalización celular y neuroanatómica implicadas en el comportamiento prosocial, el TEA y/o los síndromes relacionados con el TEA pueden subyacer a la regulación de la variación de los rasgos sociales.


La primera clase de candidatos biológicos incluye los neuropéptidos hipotalámicos oxitocina (OXT) y arginina vasopresina (AVP) [23], y los principales receptores a los que se unen para regular el comportamiento social, OXTR y AVPR1A [24, 25]. Está bien establecido que estos neuropéptidos son críticos para la expresión del comportamiento prosocial (por ejemplo, el comportamiento afiliativo, la formación del vínculo social, el cuidado parental, el aprendizaje social y la memoria) [26, 27]. Además, la interrupción experimental (farmacológica o genética) de la señalización cerebral de la OXT y la AVP produce una serie de alteraciones del comportamiento social en roedores [24, 25, 28, 29]. También se han documentado déficits en estas vías de señalización de neuropéptidos en modelos de ratón de síndromes neurogenéticos con alta penetrancia para el TEA (por ejemplo, el síndrome del cromosoma X frágil, el síndrome de Prader-Willi, el CNTNAP2) [30, 31].


La segunda clase de candidatos biológicos incluye dos vías principales de señalización de quinasas, RAS-MAPK y PI3K-AKT, que incluyen ERK1/2, PTEN y AKT(1-3). El TEA es una comorbilidad común en síndromes raros (por ejemplo, Costello, Noonan, LEOPARD y los síndromes cardio-facio-cutáneos) causados por mutaciones en moléculas de señalización inmediatamente anteriores a ERK (MEK, RAF, SPRED1 y RAS) [32, 33]. Del mismo modo, la ERK está hiperfosforilada en pacientes con el síndrome del cromosoma X frágil [34] y está implicada en la desregulación bioquímica de la esclerosis tuberosa, otro síndrome infantil asociado al TEA [35]. En la esclerosis tuberosa, el complejo heterodimérico TSC1 y TSC2 regula la vía de señalización de la quinasa AKT a mTOR y la síntesis de proteínas aguas abajo, y esta vía se ha implicado en el TEA [36]. Del mismo modo, PTEN y PI3K se encuentran aguas arriba de estas moléculas de señalización y cada vez hay más pruebas que relacionan ambas con el TEA [37, 38].


Para comprender mejor la base biológica de la variación de los rasgos sociales en los primates, aquí medimos las puntuaciones de la mSRS en una muestra de monos rhesus socialmente alojados utilizando una versión refinada y altamente fiable de la mSRS [21], como se describe a continuación. A continuación, evaluamos la consistencia del rasgo de varias "lecturas" biológicas de las vías de señalización AVP, OXT, RAS-MAPK y PI3K-AKT. Por último, probamos si alguna de las medidas biológicas fiables podía predecir de forma robusta la variación de rasgos sociales cuantitativos en esta especie.





Métodos


Diseño del estudio


En la Tabla 1 se presenta un cronograma detallado del estudio. Brevemente, las observaciones conductuales se realizaron durante un período de 15 meses en N = 76 monos rhesus. Los sujetos fueron estudiados en dos cohortes para acomodar la carga de trabajo del proyecto, y para asegurar que todas las observaciones de comportamiento se realizaran durante la temporada no reproductiva. (Restringir las observaciones conductuales a la temporada no reproductiva minimiza el impacto potencial de los cambios estacionales en el comportamiento social de los macacos en la determinación de la puntuación de la mSRS). Se recogieron muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y de sangre de todos los N = 76 sujetos. En un subconjunto de sujetos (n = 43), las muestras biológicas se recogieron tres veces durante un periodo de 10 meses. Esto nos permitió evaluar la consistencia de nuestras medidas biológicas del LCR y de la sangre a través de múltiples puntos de tiempo de una manera que no se puede lograr fácilmente en los participantes humanos. La recogida de muestras biológicas durante gran parte del año también nos permitió examinar la estabilidad de estas medidas biológicas a lo largo de las temporadas de cría y de no cría. Por último, los experimentadores fueron ciegos a las puntuaciones de mSRS de los monos durante la recogida y cuantificación de las muestras biológicas.


Tabla 1. Cronología de los procedimientos del estudio


(Véase, en inglés, en el siguiente enlace)


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00442-w/tables/1



Sujetos y lugar del estudio


Los sujetos fueron N = 76 monos rhesus macho (Macaca mulatta), nacidos y criados en el Centro Nacional de Investigación de Primates de California (CNPRC). Todos los sujetos vivían en grupos mixtos de edad y sexo de 58 a 145 individuos, con 98,22 ± 24,14 (Media ± SD) animales por grupo. Los grupos estaban formados por 2-18 matrices (Mediana: 14 matrices por grupo). Cada grupo se alojó en un corral grande de medio acre (0,19 ha) al aire libre (30,5 m de ancho X 61 m de profundidad X 9 m de alto). Los sujetos fueron alojados en 16 de los 24 corrales de campo.


Los sujetos fueron tatuados de pequeños y marcados periódicamente para facilitar su identificación en los procedimientos de cría e investigación. Los monos tenían acceso ad libitum al agua suministrada por Lixit. Se les proporcionó comida de laboratorio para primates dos veces al día y suplementos de fruta y verdura una vez a la semana. Varios juguetes, perchas para columpiarse y otras formas de enriquecimiento en cada corral, junto con el alojamiento exterior y social, proporcionaron un entorno estimulante.


Los sujetos tenían 3,73 ± 1,17 (media ± desviación estándar) años de edad y su edad oscilaba entre 1,25 y 6,27 años en el momento de la inscripción en el estudio. Los sujetos se sometieron a la recogida de datos conductuales cuantitativos como parte de un programa de investigación más amplio centrado en la biología del funcionamiento social de los macacos [21]. Los criterios de elegibilidad para la investigación de los padres incluían: varones, de 1 a 7 años de edad, alojados socialmente en cualquiera de los corrales de campo al aire libre (es decir, no alojados en el interior en jaulas individuales), médicamente sanos, y no inscritos simultáneamente en otro proyecto del CNPRC. Se dio preferencia para la inclusión en el estudio a los animales que habían sido examinados como crías en el Programa de Evaluación Bioconductual del CNPRC y que estaban alojados en un corral de campo con un mínimo de otros cinco animales elegibles.


El rango fue evaluado en cada corral por el personal de gestión del comportamiento que registró las interacciones agresivas y sumisas tras el suministro de comida. Dado que cada corral contenía un número diferente de machos, el uso del rango bruto no era efectivo como medida directa que pudiera ser comparada entre todos los sujetos. Por lo tanto, el rango se calculó como la proporción de machos en el grupo que el individuo focal superaba, de tal manera que el individuo de mayor rango tenía un valor de 1 y el individuo de menor rango tenía un valor de 0 [39]. Los rangos se evalúan mensualmente en el CNPRC; por lo tanto, utilizamos los rangos de los monos recogidos contemporáneamente con sus calificaciones de la mSRS para el propósito del análisis estadístico.



Recogida de datos conductuales


Los sujetos fueron observados discretamente en sus corrales de campo. Antes de comenzar la recogida de datos experimentales, se estableció una concordancia interobservador superior al 85%. Cada animal fue observado durante dos muestras focales de 10 minutos al día (0800-1030 y 1045-1300) durante un periodo de 2 semanas (llamado "bisemana"). Se observó un máximo de ocho sujetos (rango: de seis a ocho), que residían en uno o dos corrales, por quincena y por observador. El comportamiento se registró a intervalos de 15 segundos mediante un muestreo instantáneo y hojas de control de tiempo [40]. Al final de una bisemana (al menos 1 hora después de concluir la última observación y no más de 24 horas después de la última observación), los observadores calificaron a cada sujeto en la mSRS original de 36 ítems [20], que modificamos de una escala Likert de cuatro puntos a una de siete puntos (1 = ausencia total del rasgo, 7 = manifestación extrema del rasgo) para cada ítem [21]. Antes del resumen final, las preguntas escritas en la dirección infrecuente se puntuaron de forma inversa, de manera que las puntuaciones más altas indicaban siempre una mayor deficiencia. Dado que sólo 17 de los 36 ítems originales de la mSRS presentan una fiabilidad inter-observadores y de prueba [21], aquí se extrajeron y tabularon las puntuaciones de los 17 ítems fiables, que constituyen la base de la mSRS-Revisada (mSRS-R) [21]. La suma final de las puntuaciones totales de la mSRS-R puede oscilar entre 17 y 119. Véase el archivo adicional 1 para el instrumento mSRS-R.



Procedimientos de recogida y procesamiento de muestras biológicas


Los sujetos del presente estudio se sometieron a la recogida de muestras biológicas como parte del programa de investigación más amplio. Las muestras de LCR y sangre se recogieron por primera vez 79,37 ± 33,42 días (rango: 21 a 157 días) después de la determinación de la puntuación de la mSRS-R en todos los N = 76 monos. Se disponía de un conjunto completo de mediciones biológicas de n = 57 de estos sujetos. Otro subconjunto de estos monos (n = 43) se sometió a la recogida de muestras en dos puntos temporales adicionales para permitir la determinación de la consistencia intraindividual en las medidas biológicas para el presente estudio. Los procedimientos de muestreo fueron los mismos que los empleados en nuestra investigación anterior [41], e idénticos para cada punto de recogida de muestras.


Las muestras se recogieron entre las 08:00 y las 11:00 para minimizar cualquier efecto circadiano potencial en las mediciones biológicas. La recogida de muestras de LCR y de sangre se realizó en los 10-15 minutos siguientes a la entrada en la jaula; sólo se tomaron muestras de un mono por día en el mismo corral. Brevemente, cada sujeto fue capturado en su corral, inmovilizado rápidamente con telazol (5-8 mg/kg) y trasladado a una sala de procedimientos interior. Se utilizó ketamina suplementaria (5-8 mg/kg) según fuera necesario para facilitar la inmovilización completa. Inmediatamente después del traslado, se extrajo LCR (2 mL) de la cisterna magna mediante un procedimiento estéril estándar. Las muestras de LCR se alicuotaron inmediatamente en tubos de polipropileno siliconados de 1,5 mL y se congelaron en hielo seco.


A continuación, se extrajeron muestras de sangre total (hasta 25 mL) de la vena femoral. La sangre se recogió a temperatura ambiente en tubos vacutainer tratados con EDTA para la cuantificación de las cinasas. Las muestras se centrifugaron en un gradiente de Ficoll e hipoalergénico y las células mononucleares recogidas en la interfase se lavaron en PBS 2 veces, se pelletearon y se solubilizaron (en Tris 50 mM pH 7,4, EGTA 10 mM, NP-40 0,5% y cócteles de inhibidores de proteasas y fosfatasas). Las muestras se centrifugaron para eliminar el material insoluble y se alicuotaron. También se recogió sangre entera en tubos PAXgene para la expresión de genes de receptores de neuropéptidos. Las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 2 horas, posteriormente se transfirieron a - 20 °C durante 24 horas y luego se transfirieron a - 80 °C según las directrices del fabricante. Todas las muestras biológicas se almacenaron a - 80 °C hasta la cuantificación.


Tras la recogida de muestras, se administró profilácticamente a cada sujeto metoclopramida y ketoprofeno. Además, se administraron líquidos de reposición si era necesario según las directrices veterinarias. Los sujetos fueron colocados en una jaula de laboratorio estándar ubicada en una sala de hospitalización/transición para su recuperación durante la noche, y luego fueron devueltos a sus corrales de origen al día siguiente.



Cuantificación de neuropéptidos en LCR


Las concentraciones de OXT y AVP en el LCR se cuantificaron utilizando kits de inmunoensayo enzimático disponibles en el mercado (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) [41,42,43,44]. Estos kits han sido validados para su uso en monos rhesus y son altamente específicos y reconocen exclusivamente OXT y AVP, respectivamente, y no péptidos relacionados (es decir, la reactividad cruzada de OXT con AVP es < 0,02% y la sensibilidad mínima del ensayo es de 15 pg/mL; y la reactividad cruzada de AVP con OXT es < 0,001% y la sensibilidad mínima del ensayo es de 2,84 pg/mL). Un científico de investigación realizó la preparación de la muestra y la cuantificación de OXT y AVP siguiendo los procedimientos establecidos. Las muestras de LCR se analizaron directamente (sin extracción previa) para OXT y AVP. Todas las muestras de LCR se analizaron por duplicado (100 µl por pocillo) con un lector de microplacas sintonizable para formato de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante. Los coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo fueron 7,75% y 11,78%, respectivamente, para OXT. Los coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo fueron del 7,70% y 14,86%, respectivamente, para la AVP.



Cuantificación de receptores de neuropéptidos en sangre


La medición de los niveles de ARNm de OXTR y AVPR1A se llevó a cabo utilizando los protocolos desarrollados para los monos rhesus [41]. El ARN total fue aislado y purificado utilizando un kit de ARN sanguíneo PAXgene a partir de sangre estabilizada en tubos de ARN PAXgene (Qiagen, CA). La reacción de síntesis de ADNc de primera cadena se llevó a cabo con iScript Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad, CA) con una cantidad de ARN inicial de 1 µg en un volumen final de 20 µl. Se realizó la qPCR para determinar los niveles de expresión génica de OXTR y AVPR1A utilizando RT2 qPCR Primer Assays for Rhesus Macaque OXTR and AVPR1A (Qiagen, CA), y se utilizó el control endógeno (GAPDH, Life Technologies, CA) para la normalización. La qPCR se realizó en el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Applied Biosystems, CA) con SYBR Green (Qiagen, CA). El ADNc se amplificó por PCR por triplicado y los valores Ct de cada muestra se obtuvieron utilizando el software de qPCR QuantStudio 3. Los análisis se realizaron mediante el método Ct comparativo (2-ΔΔCt) [45].



Cuantificación de la señalización de las cinasas en sangre


Los niveles de activación de quinasas en sangre se determinaron utilizando protocolos previamente publicados [46], que habían sido optimizados para su uso en monos rhesus [41]. La proteína desnaturalizada (20 µg por carril) de la fracción citoplasmática soluble generada previamente se electroforizó a través de un gel de gradiente de poliacrilamida al 8-12% durante 2 h a 100 V a temperatura ambiente. El gel se electroblotó sobre una membrana de PVDF durante 1 h a 50 V a 4 °C. Tras el bloqueo, el blot se incubó con el anticuerpo primario (Ras, MEK1/2, fosfo-MEK1/2, Erk1/2, fosfo-Erk1/2, Pan AKT y fosfo-AKT, PTEN y fosfo-PTEN, y GAPDH, Cell Signaling, MA) durante una noche a 4 °C, se lavó y se siguió con la incubación del anticuerpo secundario fluorescente (Anti-Rabbit IgG, Cell Signaling, MA) durante 1 h a temperatura ambiente. Los blots se visualizaron utilizando el LI-COR Odyssey Imager (LI-COR Biosciences, NE).



Análisis estadísticos


Los datos se analizaron con JMP Pro 14 (SAS Institute Inc., Cary, NC). En primer lugar, se calculó la fiabilidad test-retest de los datos de la vía de señalización de neuropéptidos y quinasas como un coeficiente de correlación intraclase "Caso 2A" de consistencia estimado por un Modelo Mixto de Máxima Verosimilitud Restringido siguiendo [47]. Esto produce un tamaño del efecto equivalente a un coeficiente de correlación [47]. Como se ha indicado anteriormente, se recogieron tres muestras de un subconjunto de sujetos para este fin. Los sujetos se incluyeron en este análisis siempre que tuvieran al menos 2 de los 3 puntos temporales utilizables por medida biológica representados en los datos; todos los n = 43 monos cumplieron este umbral de inclusión.


A continuación, realizamos un análisis de componentes principales (PCA) para comprender mejor las posibles colinealidades entre las medidas biológicas fiables y su relación con la puntuación de la mSRS-R. Esto es fundamental para evitar que las colinealidades produzcan falsos negativos (o, menos probablemente, falsos positivos) en nuestro análisis final del Modelo Lineal General (GLM) (ver más abajo). Este enfoque es un ejemplo de las mejores prácticas de "análisis de sensibilidad" [48]. Dado que casi todas las medidas biológicas mostraron una alta fiabilidad test-retest, pudimos evaluar n = 57 sujetos que tenían un conjunto completo de medidas biológicas en el primer punto temporal de recogida. Los valores propios y los gráficos de dispersión sugirieron una solución de 3 componentes, que representaba el 69,1% de la varianza total. Ésta se extrajo mediante la rotación varimax para los componentes principales. Las cargas del PCA son tamaños de efecto equivalentes al coeficiente de correlación entre el componente y la variable [49].


Este PCA sugirió que la concentración de AVP en el LCR y la expresión génica diferencial de los receptores de neuropéptidos podrían predecir la puntuación de la mSRS-R, mientras que las otras medidas biológicas no parecían estar relacionadas (según las cargas de las variables). Para probar esta hipótesis, realizamos un GLM, prediciendo la puntuación de la mSRS-R, dadas las medidas biológicas fiables. El análisis controló por corral, cohorte, edad y rango. La expresión génica de OXTR y AVPR1A en sangre estaba altamente correlacionada y colineal con la expresión génica total y diferencial de los receptores de neuropéptidos. Por lo tanto, incluimos la expresión génica total de los receptores de neuropéptidos como la suma de la expresión génica de OXTR y AVPR1A para capturar la expresión correlacionada de los dos genes, y la expresión génica diferencial de los receptores de neuropéptidos como la diferencia entre la expresión génica de OXTR y AVPR1A para capturar la regulación relativa ascendente o descendente de estos receptores. Todas las demás medidas biológicas fiables se incluyeron en el análisis. Este enfoque prueba de forma conservadora cada medida biológica controlando todas las demás, y así identifica las variables que impulsan una relación mientras excluye las variables que sólo están correlacionadas de forma secundaria. Los supuestos del MLG (normalidad del error, homogeneidad de la varianza y linealidad) se probaron gráficamente. No se requirieron transformaciones. Como se indicó anteriormente, n = 57 sujetos tenían conjuntos de muestras biológicas completas disponibles en el primer punto de tiempo de recogida para el análisis. Sin embargo, la concentración de AVP en el LCR se había cuantificado en todos los N = 76 sujetos, y se disponía de un valor de AVP de n = 75 de ellos. Esto nos permitió realizar un análisis de seguimiento en toda la muestra del estudio excluyendo todas las medidas biológicas excepto la concentración de AVP en LCR, pero incluyendo todos los factores de bloqueo mencionados anteriormente, en el modelo.


Los métodos avanzados que se emplean aquí aumentan en gran medida la potencia y reducen el tamaño de la muestra (a menudo entre 5 y 10 veces) con respecto a análisis como las pruebas T o la regresión simple, al tiempo que reducen los falsos positivos [50,51,52,53,54]. Sin embargo, no existen cálculos formales de potencia a priori similares a los utilizados para análisis más sencillos para los análisis empleados aquí. Como hemos argumentado nosotros y otros [50, 55, 56], el mejor enfoque para los cálculos de potencia a priori para los análisis avanzados es la Ecuación de Recursos de Mead [57]. La Ecuación de Recursos de Mead proporciona un tamaño de muestra por encima del cual los sujetos adicionales tendrán poco impacto en la potencia; este tamaño era menor que el número de sujetos que teníamos disponibles para cada análisis. Por lo tanto, optamos por utilizar todos los sujetos de los que disponíamos de datos, observando que todos estos análisis tienen una potencia adecuada. Por último, los tamaños del efecto para estos análisis GLM se reportan como eta parcial al cuadrado (ηp2), que es el cuadrado del coeficiente de correlación parcial rp para los predictores continuos, siguiendo la mejor práctica para GLMs [50].




Resultados


Las medidas biológicas asociadas al autismo demuestran una sólida fiabilidad test-retest


Todas las medidas de señalización de neuropéptidos y quinasas (excepto AKT fosforilada / AKT total) mostraron una significativa fiabilidad test-retest dentro de los individuos a través de múltiples puntos de tiempo de recogida (Tabla 2). Los coeficientes de correlación intraclase de fiabilidad test-retest oscilaron entre el 42,0 y el 88,6% para las medidas biológicas fiables. Estas medidas abarcaron un periodo de recogida de 10 meses (incluyendo las temporadas de cría y de no cría) e indican que los cambios circadianos en el comportamiento de cría no afectan significativamente a la consistencia de estas medidas.


Tabla 2. Consistencia intraindividual de las medidas biológicas


(Véase, en inglés, en el siguiente enlace)


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00442-w/tables/2



Distribución continua de las puntuaciones de la mSRS-R en la población general de monos


Las puntuaciones de la mSRS-R en esta muestra oscilaron entre 26 y 88. Como se ha observado en anteriores estudios de investigación sobre la distribución de las puntuaciones de la SRS en la población humana general [10, 58], las puntuaciones de la mSRS-R en esta muestra de monos rhesus también se distribuyeron de forma continua en la población general. Como también se ha observado en poblaciones humanas [9, 59], las puntuaciones de la mSRS-R estaban desviadas de una distribución normal, lo que indica que las deficiencias más graves son relativamente raras en esta especie de monos (Fig. 1a). (Observamos que estos datos de la mSRS-R reflejan un subconjunto de animales de un estudio conductual más amplio [21] y, por tanto, no constituyen una muestra de replicación independiente).



Figura 1



Las puntuaciones de la Escala de Respuesta Social Revisada de los macacos (mSRS-R) y la concentración de arginina vasopresina (AVP) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) en macacos rhesus machos de la población general. a Las puntuaciones de la mSRS-R se representan en forma de histograma (N = 76), y las puntuaciones más altas indican un mayor deterioro social. Las puntuaciones totales de la mSRS-R podían oscilar entre 17 y 119. Encima del histograma se muestra el correspondiente gráfico de cajas y bigotes. El recuadro muestra el rango intercuartil, la línea la mediana, los bigotes los percentiles 10 y 90, y los círculos negros cualquier dato fuera de este rango. b La concentración de AVP en el LCR predice negativamente la puntuación de la mSRS-R (n = 57), de manera que los individuos con la menor concentración de AVP en el LCR muestran el mayor deterioro social. La puntuación observada en la mSRS-R se representa en función de la concentración de AVP en el LCR. Por lo tanto, la concentración de AVP en LCR se corrige (se particiona) para las otras variables en el análisis y se escala al rango de los datos originales de concentración de AVP en LCR




Un componente principal carga la puntuación de la mSRS-R y un subconjunto de medidas biológicas asociadas al autismo


El ACP extrajo una solución de tres componentes. Sólo un componente cargó la puntuación mSRS-R y lo hizo junto con dos medidas biológicas: La concentración de AVP en el LCR y la expresión génica del receptor de neuropéptidos diferencial en sangre. Las otras medidas biológicas se cargaron en dos componentes separados (Tabla 3).


Tabla 3. Análisis de componentes principales incluyendo medidas biológicas y la puntuación de la mSRS-R


(Véase, en inglés, en el siguiente enlace)


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00442-w/tables/3


La concentración de AVP en el LCR predice la variación de los rasgos sociales cuantitativos en la población general de monos


A continuación, utilizamos el MLG para comprobar la contribución de las medidas biológicas a la puntuación de la mSRS-R. Sólo la concentración de AVP en el LCR predijo significativamente la puntuación de la mSRS-R, y las concentraciones más bajas de AVP en el LCR predijeron puntuaciones más altas en la mSRS-R (F1,34 = 6,629; P = 0,0146; ηp2 = 16,3%; rp = - 40,4%; Fig. 1b). A continuación, confirmamos este resultado volviendo a realizar el análisis, pero excluyendo las otras medidas biológicas, lo que nos permitió incluir un mayor número de sujetos con valores de AVP en LCR disponibles. El resultado se mantuvo en la muestra más grande del estudio (F1,55 = 4,555; P = 0,0373; ηp2 = 7,65%; rp = - 27,7%).



Discusión


Este estudio investigó potenciales biomarcadores de variación de rasgos sociales cuantitativos en monos rhesus macho de la población general del CNPRC. Todas las medidas biológicas (excepto la AKT) mostraron una fiabilidad significativa en la prueba de reexamen dentro de los individuos a través de los puntos de tiempo. El PCA reveló una asociación potencial entre la concentración de AVP en el LCR y la puntuación de la mSRS-R; esta relación fue confirmada posteriormente por el GLM (que también indicó que ninguna de las covariables, incluyendo la edad y el rango, afectaba a las puntuaciones de la mSRS-R). Específicamente, la concentración de AVP en el LCR, pero ninguna otra medida biológica que probamos, predijo sólidamente las diferencias individuales en la puntuación de la mSRS-R, de manera que los monos con la menor concentración de AVP en el LCR mostraron el mayor deterioro social. Estos hallazgos refuerzan los de un estudio anterior que informaba de la consistencia estable dentro del individuo de la concentración de AVP en el LCR en una muestra modesta de N = 10 monos [41], y se suman a la creciente evidencia que vincula las diferencias individuales en la concentración de AVP en el LCR con las diferencias individuales en el funcionamiento social de los primates, incluyendo el comportamiento de acicalamiento en los macacos [41] y las puntuaciones de gravedad calibradas del Programa de Observación Diagnóstica del Autismo en personas con TEA [42].


Se sabe desde hace casi tres décadas que la señalización de la AVP desempeña un papel fundamental en el comportamiento prosocial de los mamíferos. La AVP se implicó por primera vez en la formación del vínculo social y el cuidado paterno en los topillos [28, 60, 61]. Posteriormente, se demostró que la desregulación experimental de la vía de señalización cerebral de la AVP producía déficits sociales en ratones y topillos [24, 28, 29]. Aunque se sabe mucho menos sobre la biología del funcionamiento social en los primates, hemos demostrado que los monos adultos naturalmente poco sociales, que inician menos interacciones afiliativas, pasan menos tiempo en contacto físico y acicalándose con sus congéneres, y muestran anormalidades apreciables en el procesamiento de la información social (por ejemplo, déficits en el reconocimiento de rostros y alteración de la aversión a la mirada típica de la especie en respuesta a la agresión de los congéneres) [41, 62,63,64], presentan concentraciones más bajas de AVP en el LCR en comparación con sus compañeros socialmente competentes [41]. El silenciamiento natural de la actividad génica de la AVP desde el nacimiento también se asocia con fuertes déficits de desarrollo social en ratas de Brattleboro [65, 66], lo que sugiere la intrigante posibilidad de que el deterioro temprano de la señalización cerebral de la AVP pueda contribuir de forma similar a la patogénesis de los déficits sociales en los seres humanos jóvenes.


Estos hallazgos que implican a la AVP en el funcionamiento prosocial de los mamíferos nos llevaron recientemente a investigar si la concentración de AVP en el LCR es menor en los casos de TEA que en los controles. Este fue el caso, ya que en dos cohortes independientes de TEA, la concentración de AVP en el LCR diferenció con precisión los casos de TEA pediátricos y los controles (de 1,5 a 19 años). En concreto, en todo el rango de concentraciones de AVP en LCR, la probabilidad de TEA aumenta más de 1.000 veces, lo que corresponde a un aumento de casi 500 veces en el riesgo con cada disminución de 10 veces en la concentración de AVP en LCR [41, 42]. Recientemente también hemos comprobado el valor predictivo de la AVP mediante la extracción de más de 900 muestras de LCR recogidas durante la atención estándar de recién nacidos humanos de 0 a 3 meses. Encontramos que los individuos diagnosticados con TEA más tarde en la infancia tienen concentraciones de AVP neonatales significativamente más bajas en el LCR en comparación con aquellos que no reciben posteriormente un diagnóstico de TEA [43]. Estos hallazgos colectivos sugieren que un marcador neuroquímico del funcionamiento social deteriorado puede estar presente muy temprano en la vida, muchos meses o incluso años, antes de que los síntomas conductuales emerjan por primera vez.


Está bien establecido que el TEA es un trastorno cerebral heredado principalmente poligénico [67], y actualmente se han identificado aproximadamente 100 genes de susceptibilidad al TEA [68]. Curiosamente, el propio AVP no ha sido identificado como un gen de riesgo de TEA de alta confianza por el gen SFARI, una amplia base de datos que cataloga y puntúa todos los genes humanos conocidos para la susceptibilidad al TEA [69]. Entonces, ¿cómo podríamos conciliar los hallazgos sobre el papel de la AVP en el funcionamiento prosocial de los mamíferos [28, 60, 70] con las pruebas bien documentadas de que los rasgos endofenotípicos autistas son comunes, altamente heredables y se distribuyen continuamente en la población humana general [58, 71]? Sugerimos que la señalización cerebral de la AVP puede ser una vía descendente crítica para la expresión de los síntomas del TEA, y un punto de convergencia para múltiples y diversos genes de susceptibilidad al TEA. Esto explicaría nuestros hallazgos que relacionan la variación en la concentración de AVP en el LCR con la variación en el comportamiento de acicalamiento en monos [41] y la gravedad de los síntomas clínicos en pacientes con TEA [42]. Esto también explicaría por qué el tratamiento con AVP intranasal mejora las habilidades sociales en pacientes con TEA idiopático, como informamos recientemente en un ensayo piloto de fase 2a doble ciego, aleatorizado y controlado con placebo [72].



Limitaciones


Este estudio tiene varias limitaciones que merecen ser comentadas. En primer lugar, aunque utilizamos un sofisticado modelo de primates que permitió la traducción inversa de una escala que mide la variación de los rasgos sociales y autistas en los seres humanos, reconocemos que los modelos animales son, sin embargo, aproximaciones para examinar las enfermedades del neurodesarrollo humano. En segundo lugar, la relación entre la concentración de AVP en el LCR y la puntuación de la mSRS-R en este estudio fue correlacional, no causal. Además, la medición de la AVP en el LCR cisternal impidió una comprensión más mecánica del papel de la AVP en el funcionamiento social de los primates.


Se necesitarán futuras investigaciones que utilicen herramientas de vectores virales, optogenética, edición de genes y/o radiotrazadores de tomografía de emisión de positrones para abordar esta cuestión de una manera más manejable. En tercer lugar, a diferencia de las medidas biológicas de este estudio, que se evaluaron tres veces, las puntuaciones de la mSRS-R sólo se evaluaron una vez por sujeto, utilizando un instrumento relativamente nuevo.


Sin embargo, previamente evaluamos las propiedades psicométricas de la mSRS de 36 ítems, y en el proceso omitimos todos los ítems que no mostraban una fiabilidad robusta de prueba-retest e inter-agente, dando como resultado la mSRS-R de 17 ítems altamente fiable.


También observamos que las puntuaciones de la mSRS-R están estrechamente relacionadas con otras múltiples medidas de funcionamiento social [21]. En cuarto lugar, aunque evaluamos medidas biológicas que habían sido previamente implicadas en el comportamiento prosocial, el TEA, y/o los síndromes relacionados con el TEA, no observamos aquí relaciones entre la concentración de OXT en el LCR o la señalización de la quinasa en sangre y la variación de los rasgos sociales. Esto contrasta con investigaciones anteriores en humanos que han vinculado la concentración neonatal de OXT en el LCR con el compromiso social posterior [73], y la señalización de la quinasa en sangre con el TEA y la gravedad de sus síntomas [74,75,76]. Sin embargo, la ausencia de pruebas que impliquen estas medidas biológicas en el funcionamiento social de los monos no es necesariamente una prueba de ausencia. Esto puede ser especialmente cierto en el caso de las medidas de señalización de la cinasa en sangre, ya que el presente estudio no capturó el extremo teórico de las puntuaciones de la mSRS-R (es decir, la puntuación más alta de la mSRS-R aquí fue de 88 de 119 posibles), y la distribución de las puntuaciones estaba estadísticamente sesgada hacia los animales con menos deterioro social. Por lo tanto, es posible que la relación entre la señalización de la quinasa en sangre y la variación del comportamiento social sólo sea evidente cuando se estudia en una muestra de los monos con mayor deterioro social. Por último, este estudio se limitó a los sujetos masculinos, debido a nuestro interés más amplio en la investigación para comprender mejor los fundamentos biológicos del TEA, que afecta cuatro veces más a los hombres que a las mujeres [77]. No obstante, el TEA afecta a las niñas, y queda por determinar si la relación entre la concentración de AVP en el LCR y la variación de los rasgos sociales se mantiene en los sujetos femeninos.



Conclusiones


En conclusión, este estudio supuso un primer paso hacia una mejor comprensión de las bases biológicas de la variación cuantitativa de los rasgos sociales en los primates. Los resultados de este estudio establecieron la consistencia de los rasgos de casi todas las "lecturas" biológicas de las vías de señalización AVP, OXT, RAS-MAPK y PI3K-AKT en los monos rhesus. Por último, la concentración de AVP en el LCR predijo sólidamente la variación cuantitativa de los rasgos sociales en esta especie. Ahora es necesario investigar para comprender mejor el papel de la vía de señalización de la AVP en el funcionamiento social típico y atípico de los primates, y en los primates humanos, la implicación de la AVP en el extremo de la distribución de rasgos sociales, particularmente en la patogénesis del TEA.



Disponibilidad de datos y materiales


Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.



Abreviaturas


AAALAC Internacional:

Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional


TEA:

Trastorno del espectro autista


AVP:

Arginina vasopresina


CNPRC:

Centro Nacional de Investigación de Primates de California


LCR:

Líquido cefalorraquídeo


GLM:

Modelo lineal general


IACUCs:

Comités institucionales para el cuidado y uso de animales


CCI:

Coeficiente de correlación intraclase


mSRS:

Escala de respuesta social de los macacos


mSRS-R:

Escala de respuesta social de los macacos-revisada


OXT:

Oxitocina


PC:

Componente principal


PCA:

Análisis de componentes principales


SD:

Desviaciones estándar


SE:

Error estándar


SRS:

Escala de respuesta social


UCSF:

Universidad de California, San Francisco



Referencias


Download references


Agradecimientos


Agradecemos a JoAnn Yee, Josh Herrington, Alicia Bulleri, Kylee Beck, Jiang Li, Adam Myers, Jesús Madrid, Natalie Lange y Sophie Rose por ayudar en varios aspectos de esta investigación, y al personal del CNPRC por mantener la salud y el bienestar de los animales.


Financiación

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Simons (SFARI 342873), los Institutos Nacionales de Salud (R01HD087048; P51OD011107), y el Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento de Stanford. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos, el análisis, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.


Información del autor

Afiliaciones

Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Universidad de Stanford, 1201 Welch Rd., MSLS P-104, Stanford, CA, 94305, USA


Ozge Oztan, Noreen Mohsin, Joseph P. Garner y Karen J. Parker


California National Primate Research Center, 1 Shields Ave., Davis, CA, 95616, USA


Catherine F. Talbot, Alyssa C. Maness, Sierra M. Simmons, Laura A. Del Rosso, John P. Capitanio y Karen J. Parker


Departamento de Neurología, Universidad de California, 675 Nelson Rising Lane, San Francisco, CA, 94158, USA


Emanuela Argilli y Elliott H. Sherr


Departamento de Medicina Comparada, Universidad de Stanford, 300 Pasteur Dr., Edwards R348, Stanford, CA, 94305, USA


Joseph P. Garner


Departamento de Psicología, Universidad de California, 1 Shields Ave., Davis, 95616, USA


John P. Capitanio


Contribuciones

OO, CFT, JPG, EHS, JPC y KJP diseñaron el estudio. KJP, JPC, JPG y EHS aseguraron la financiación de esta investigación. KJP supervisó la ejecución del estudio en general. JPC supervisó la ejecución de los datos conductuales y la recogida de muestras biológicas en el CNPRC. LADR llevó a cabo la confiabilidad del comportamiento con el personal para las observaciones de corral en el exterior. LADR formó al personal en la recogida de muestras biológicas. OO capacitó al personal en el procesamiento de muestras biológicas. CFT, ACM y SMS realizaron la recogida de datos sobre el comportamiento. CFT, ACM, SMS y LADR realizaron la recogida de muestras biológicas. KJP y EHS supervisaron la cuantificación de muestras biológicas en la Universidad de Stanford y la UCSF, respectivamente. OO, EA y NM realizaron la preparación y/o cuantificación de las muestras biológicas. OO, CFT, EA, ACM, SMS, LADR y JPG realizaron la agregación de datos, la introducción de datos y/o la limpieza de datos. JPG realizó los análisis estadísticos y creó las tablas y figuras. KJP, OO, y JPG escribió el primer borrador del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.


Información de los autores


Nuestro equipo de investigación incluye un bioestadístico (JPG). JPG tiene una larga experiencia en modelos estadísticos avanzados y poder. También es una autoridad líder en la reproducibilidad y la traducción de modelos animales.


Autor correspondiente

Correspondencia a Karen J. Parker.


Declaraciones éticas

Aprobación ética

Todos los procedimientos fueron revisados y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, Davis y de la Universidad de Stanford. Estos procedimientos cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las políticas de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales. El CNPRC y la Universidad de California, Davis, están acreditados por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International).


Consentimiento para la publicación

No procede.


Intereses contrapuestos

El Consejo de Administración de la Universidad Leland Stanford Junior y los regentes de la Universidad de California, San Francisco (UCSF) han presentado solicitudes de patentes relacionadas con las medidas biológicas estudiadas en este documento (Universidad de Stanford: PCT/US2019/019029 "Methods for diagnosing and for determining severity of an autism spectrum disorder"; UCSF: PCT/US2016/014623 "Methods of diagnosing and treating autism spectrum disorders"). Estas patentes no han sido concedidas ni licenciadas, y ningún autor del estudio está recibiendo ninguna compensación económica en este momento. EHS forma parte del consejo asesor de Retrophin Inc. Todos los demás autores declaran que no tienen intereses en competencia.


Información adicional

Nota del editor

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales.


Derechos y permisos

Acceso abierto. Este artículo tiene una licencia de Creative Commons Atribución 4.0 Internacional, que permite el uso, la compartición, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se dé el debido crédito al autor o autores originales y a la fuente, se facilite un enlace a la licencia de Creative Commons y se indique si se han realizado cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La renuncia a la Dedicación de Dominio Público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos puestos a disposición en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.


Cite este artículo

Oztan, O., Talbot, C.F., Argilli, E. et al. Biomarcadores asociados al autismo: fiabilidad de la prueba y relación con la variación del rasgo social cuantitativo en monos rhesus. Molecular Autism 12, 50 (2021). https://doi.org/10.1186/s13229-021-00442-w



Anexos en inglés en el siguiente enlace:


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00442-w


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