Biomarcadores asociados al TEA: fiabilidad de la prueba y relación con la variación de rasgo social




POR OZGE OZTAN, CATHERINE F. TALBOT, EMANUELA ARGILLI, ALYSSA C. MANESS, SIERRA M. SIMMONS, NOREEN MOHSIN, LAURA A. DEL ROSSO, JOSEPH P. GARNER, ELLIOTT H. SHERR, JOHN P. CAPITANIO Y KAREN J. PARKER

Fuente: Molecular Autism | 08/07/2021

Fotografía: Pixabay


Molecular Autism volumen 12, número de artículo: 50 (2021)


Biomarcadores asociados al autismo: fiabilidad de la prueba y relación con la variación de rasgos sociales cuantitativos en monos Rhesus


Resumen


Antecedentes


Los monos Rhesus (Macaca mulatta) presentan pronunciadas diferencias individuales en los rasgos sociales, según la medición de la Escala de Sensibilidad Social de los macacos-Revisada. La Escala de Sensibilidad Social de los macacos se adaptó previamente de la Escala de Sensibilidad Social, un instrumento diseñado para evaluar la variación de los rasgos sociales y autistas en los seres humanos.

Para comprender mejor los posibles fundamentos biológicos de esta variación conductual, evaluamos la consistencia de rasgos de varias medidas biológicas previamente implicadas en el autismo (por ejemplo, arginina vasopresina, oxitocina y sus receptores, así como ERK1/2, PTEN y AKT(1-3) de las vías RAS-MAPK y PI3K-AKT). También comprobamos qué medidas biológicas predecían las puntuaciones de la Escala de Sensibilidad Social Revisada de los macacos.



Métodos


Se recogieron muestras de líquido cefalorraquídeo y de sangre de N = 76 monos machos que, como muestra, mostraron una distribución continua en la Escala de Sensibilidad Social de los macacos-Revisada. En un subconjunto de estos sujetos (n = 43), las muestras se recogieron tres veces durante un período de 10 meses. Se utilizaron las siguientes pruebas estadísticas: Coeficientes de correlación intraclase "Caso 2A" de consistencia, análisis de componentes principales y modelización lineal general.



Resultados


Todas las medidas biológicas (excepto la AKT) mostraron una significativa fiabilidad de prueba-retest dentro de los individuos a través de los puntos de tiempo. A continuación, realizamos un análisis de componentes principales sobre los datos de los monos con conjuntos completos de medidas biológicas en el primer punto temporal (n = 57), para explorar posibles correlaciones entre las medidas biológicas fiables y su relación con la puntuación de la Escala de Sensibilidad Social Revisada de los macacos; se encontró una solución de tres componentes. Los análisis de seguimiento revelaron que la concentración de arginina vasopresina en el líquido cefalorraquídeo, pero ninguna otra medida biológica, predijo de forma sólida las diferencias individuales en las puntuaciones de la Escala de Respuesta Social Revisada de los macacos, de forma que los monos con la menor concentración de arginina vasopresina en el líquido cefalorraquídeo mostraron el mayor deterioro social. Por último, confirmamos que este resultado se mantuvo en la muestra más amplia del estudio (en la que se disponía de los valores de arginina vasopresina en líquido cefalorraquídeo de n = 75 de los sujetos).



Conclusiones


Estos resultados indican que la concentración de arginina vasopresina en el líquido cefalorraquídeo es una medida estable de tipo rasgo y que está vinculada a la variación cuantitativa de rasgos sociales en los monos rhesus macho.



Antecedentes


Todas las especies de primates son sociales durante al menos una parte de su vida [1]. La sociabilidad requiere la capacidad de reconocer y recordar a sus congéneres, comunicar información de manera efectiva, interactuar de una manera típica de la especie, y adquirir y utilizar el conocimiento sobre las relaciones sociales que existen entre los miembros de su grupo social [2]. Sin embargo, en las especies de primates no humanos son evidentes las pronunciadas variaciones individuales en el funcionamiento social [3, 4]. Aunque esta variación social ha sido bien documentada, no ha sido estudiada sistemáticamente [5].


La introducción de la Escala de Sensibilidad Social (SRS) facilitó la evaluación rápida y a gran escala de la variación de los rasgos sociales en los seres humanos [6, 7]. Esta escala proporciona una medida cuantitativa del funcionamiento social típico y atípico en entornos sociales naturales [8, 9]. Esta escala se puntúa de forma que las puntuaciones más altas del SRS indican un mayor deterioro social. Se ha demostrado que las puntuaciones del SRS se distribuyen de forma continua en la población humana general [10]. En el extremo de la distribución de la población, las puntuaciones más altas del SRS se solapan significativamente con un diagnóstico de trastorno del espectro autista (TEA) [8, 11], un trastorno cerebral caracterizado por déficits cognitivos y de interacción social básicos [12]. Esta evidencia colectiva ha permitido el uso del SRS como herramienta de investigación para medir la presencia de rasgos autistas en miembros de la población humana general [7, 13], y como herramienta de cribado clínico para el TEA [8, 9].


El SRS ha demostrado ser una medida útil de la variación social en múltiples y diversas sociedades humanas [14,15,16,17]. Dada su amplia aplicabilidad en humanos, el SRS ha sido adaptado para su uso en chimpancés [18, 19] y macacos rhesus [20] para permitir la evaluación de la presencia de rasgos sociales similares en estas especies. En consonancia con la puntuación total del SRS humano [10], las puntuaciones del SRS de los chimpancés y del SRS de los macacos (mSRS) se distribuyen de forma continua en sus respectivas poblaciones generales [18,19,20,21]. Además, los monos rhesus observados con 1,5 desviaciones estándar (SD) por encima de la media de la población en el comportamiento no social que se produce de forma natural también se clasifican como con una mayor carga de rasgos similares al autismo [21].


Actualmente se sabe muy poco sobre los fundamentos biológicos de la variación cuantitativa de los rasgos sociales en primates humanos y no humanos. Esto se debe a que las investigaciones biológicas previas se han centrado típicamente en el desarrollo del comportamiento social típico de la especie (por ejemplo, el inicio del comportamiento parental; la formación del vínculo social) en especies de roedores [22]. Sin embargo, varias vías de señalización celular y neuroanatómica implicadas en el comportamiento prosocial, el TEA y/o los síndromes relacionados con el TEA pueden subyacer a la regulación de la variación de los rasgos sociales.


La primera clase de candidatos biológicos incluye los neuropéptidos hipotalámicos oxitocina (OXT) y arginina vasopresina (AVP) [23], y los principales receptores a los que se unen para regular el comportamiento social, OXTR y AVPR1A [24, 25]. Está bien establecido que estos neuropéptidos son críticos para la expresión del comportamiento prosocial (por ejemplo, el comportamiento afiliativo, la formación del vínculo social, el cuidado parental, el aprendizaje social y la memoria) [26, 27]. Además, la interrupción experimental (farmacológica o genética) de la señalización cerebral de la OXT y la AVP produce una serie de alteraciones del comportamiento social en roedores [24, 25, 28, 29]. También se han documentado déficits en estas vías de señalización de neuropéptidos en modelos de ratón de síndromes neurogenéticos con alta penetrancia para el TEA (por ejemplo, el síndrome del cromosoma X frágil, el síndrome de Prader-Willi, el CNTNAP2) [30, 31].


La segunda clase de candidatos biológicos incluye dos vías principales de señalización de quinasas, RAS-MAPK y PI3K-AKT, que incluyen ERK1/2, PTEN y AKT(1-3). El TEA es una comorbilidad común en síndromes raros (por ejemplo, Costello, Noonan, LEOPARD y los síndromes cardio-facio-cutáneos) causados por mutaciones en moléculas de señalización inmediatamente anteriores a ERK (MEK, RAF, SPRED1 y RAS) [32, 33]. Del mismo modo, la ERK está hiperfosforilada en pacientes con el síndrome del cromosoma X frágil [34] y está implicada en la desregulación bioquímica de la esclerosis tuberosa, otro síndrome infantil asociado al TEA [35]. En la esclerosis tuberosa, el complejo heterodimérico TSC1 y TSC2 regula la vía de señalización de la quinasa AKT a mTOR y la síntesis de proteínas aguas abajo, y esta vía se ha implicado en el TEA [36]. Del mismo modo, PTEN y PI3K se encuentran aguas arriba de estas moléculas de señalización y cada vez hay más pruebas que relacionan ambas con el TEA [37, 38].


Para comprender mejor la base biológica de la variación de los rasgos sociales en los primates, aquí medimos las puntuaciones de la mSRS en una muestra de monos rhesus socialmente alojados utilizando una versión refinada y altamente fiable de la mSRS [21], como se describe a continuación. A continuación, evaluamos la consistencia del rasgo de varias "lecturas" biológicas de las vías de señalización AVP, OXT, RAS-MAPK y PI3K-AKT. Por último, probamos si alguna de las medidas biológicas fiables podía predecir de forma robusta la variación de rasgos sociales cuantitativos en esta especie.





Métodos


Diseño del estudio


En la Tabla 1 se presenta un cronograma detallado del estudio. Brevemente, las observaciones conductuales se realizaron durante un período de 15 meses en N = 76 monos rhesus. Los sujetos fueron estudiados en dos cohortes para acomodar la carga de trabajo del proyecto, y para asegurar que todas las observaciones de comportamiento se realizaran durante la temporada no reproductiva. (Restringir las observaciones conductuales a la temporada no reproductiva minimiza el impacto potencial de los cambios estacionales en el comportamiento social de los macacos en la determinación de la puntuación de la mSRS). Se recogieron muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y de sangre de todos los N = 76 sujetos. En un subconjunto de sujetos (n = 43), las muestras biológicas se recogieron tres veces durante un periodo de 10 meses. Esto nos permitió evaluar la consistencia de nuestras medidas biológicas del LCR y de la sangre a través de múltiples puntos de tiempo de una manera que no se puede lograr fácilmente en los participantes humanos. La recogida de muestras biológicas durante gran parte del año también nos permitió examinar la estabilidad de estas medidas biológicas a lo largo de las temporadas de cría y de no cría. Por último, los experimentadores fueron ciegos a las puntuaciones de mSRS de los monos durante la recogida y cuantificación de las muestras biológicas.


Tabla 1. Cronología de los procedimientos del estudio


(Véase, en inglés, en el siguiente enlace)


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00442-w/tables/1



Sujetos y lugar del estudio


Los sujetos fueron N = 76 monos rhesus macho (Macaca mulatta), nacidos y criados en el Centro Nacional de Investigación de Primates de California (CNPRC). Todos los sujetos vivían en grupos mixtos de edad y sexo de 58 a 145 individuos, con 98,22 ± 24,14 (Media ± SD) animales por grupo. Los grupos estaban formados por 2-18 matrices (Mediana: 14 matrices por grupo). Cada grupo se alojó en un corral grande de medio acre (0,19 ha) al aire libre (30,5 m de ancho X 61 m de profundidad X 9 m de alto). Los sujetos fueron alojados en 16 de los 24 corrales de campo.


Los sujetos fueron tatuados de pequeños y marcados periódicamente para facilitar su identificación en los procedimientos de cría e investigación. Los monos tenían acceso ad libitum al agua suministrada por Lixit. Se les proporcionó comida de laboratorio para primates dos veces al día y suplementos de fruta y verdura una vez a la semana. Varios juguetes, perchas para columpiarse y otras formas de enriquecimiento en cada corral, junto con el alojamiento exterior y social, proporcionaron un entorno estimulante.


Los sujetos tenían 3,73 ± 1,17 (media ± desviación estándar) años de edad y su edad oscilaba entre 1,25 y 6,27 años en el momento de la inscripción en el estudio. Los sujetos se sometieron a la recogida de datos conductuales cuantitativos como parte de un programa de investigación más amplio centrado en la biología del funcionamiento social de los macacos [21]. Los criterios de elegibilidad para la investigación de los padres incluían: varones, de 1 a 7 años de edad, alojados socialmente en cualquiera de los corrales de campo al aire libre (es decir, no alojados en el interior en jaulas individuales), médicamente sanos, y no inscritos simultáneamente en otro proyecto del CNPRC. Se dio preferencia para la inclusión en el estudio a los animales que habían sido examinados como crías en el Programa de Evaluación Bioconductual del CNPRC y que estaban alojados en un corral de campo con un mínimo de otros cinco animales elegibles.


El rango fue evaluado en cada corral por el personal de gestión del comportamiento que registró las interacciones agresivas y sumisas tras el suministro de comida. Dado que cada corral contenía un número diferente de machos, el uso del rango bruto no era efectivo como medida directa que pudiera ser comparada entre todos los sujetos. Por lo tanto, el rango se calculó como la proporción de machos en el grupo que el individuo focal superaba, de tal manera que el individuo de mayor rango tenía un valor de 1 y el individuo de menor rango tenía un valor de 0 [39]. Los rangos se evalúan mensualmente en el CNPRC; por lo tanto, utilizamos los rangos de los monos recogidos contemporáneamente con sus calificaciones de la mSRS para el propósito del análisis estadístico.



Recogida de datos conductuales


Los sujetos fueron observados discretamente en sus corrales de campo. Antes de comenzar la recogida de datos experimentales, se estableció una concordancia interobservador superior al 85%. Cada animal fue observado durante dos muestras focales de 10 minutos al día (0800-1030 y 1045-1300) durante un periodo de 2 semanas (llamado "bisemana"). Se observó un máximo de ocho sujetos (rango: de seis a ocho), que residían en uno o dos corrales, por quincena y por observador. El comportamiento se registró a intervalos de 15 segundos mediante un muestreo instantáneo y hojas de control de tiempo [40]. Al final de una bisemana (al menos 1 hora después de concluir la última observación y no más de 24 horas después de la última observación), los observadores calificaron a cada sujeto en la mSRS original de 36 ítems [20], que modificamos de una escala Likert de cuatro puntos a una de siete puntos (1 = ausencia total del rasgo, 7 = manifestación extrema del rasgo) para cada ítem [21]. Antes del resumen final, las preguntas escritas en la dirección infrecuente se puntuaron de forma inversa, de manera que las puntuaciones más altas indicaban siempre una mayor deficiencia. Dado que sólo 17 de los 36 ítems originales de la mSRS presentan una fiabilidad inter-observadores y de prueba [21], aquí se extrajeron y tabularon las puntuaciones de los 17 ítems fiables, que constituyen la base de la mSRS-Revisada (mSRS-R) [21]. La suma final de las puntuaciones totales de la mSRS-R puede oscilar entre 17 y 119. Véase el archivo adicional 1 para el instrumento mSRS-R.



Procedimientos de recogida y procesamiento de muestras biológicas


Los sujetos del presente estudio se sometieron a la recogida de muestras biológicas como parte del programa de investigación más amplio. Las muestras de LCR y sangre se recogieron por primera vez 79,37 ± 33,42 días (rango: 21 a 157 días) después de la determinación de la puntuación de la mSRS-R en todos los N = 76 monos. Se disponía de un conjunto completo de mediciones biológicas de n = 57 de estos sujetos. Otro subconjunto de estos monos (n = 43) se sometió a la recogida de muestras en dos puntos temporales adicionales para permitir la determinación de la consistencia intraindividual en las medidas biológicas para el presente estudio. Los procedimientos de muestreo fueron los mismos que los empleados en nuestra investigación anterior [41], e idénticos para cada punto de recogida de muestras.


Las muestras se recogieron entre las 08:00 y las 11:00 para minimizar cualquier efecto circadiano potencial en las mediciones biológicas. La recogida de muestras de LCR y de sangre se realizó en los 10-15 minutos siguientes a la entrada en la jaula; sólo se tomaron muestras de un mono por día en el mismo corral. Brevemente, cada sujeto fue capturado en su corral, inmovilizado rápidamente con telazol (5-8 mg/kg) y trasladado a una sala de procedimientos interior. Se utilizó ketamina suplementaria (5-8 mg/kg) según fuera necesario para facilitar la inmovilización completa. Inmediatamente después del traslado, se extrajo LCR (2 mL) de la cisterna magna mediante un procedimiento estéril estándar. Las muestras de LCR se alicuotaron inmediatamente en tubos de polipropileno siliconados de 1,5 mL y se congelaron en hielo seco.


A continuación, se extrajeron muestras de sangre total (hasta 25 mL) de la vena femoral. La sangre se recogió a temperatura ambiente en tubos vacutainer tratados con EDTA para la cuantificación de las cinasas. Las muestras se centrifugaron en un gradiente de Ficoll e hipoalergénico y las células mononucleares recogidas en la interfase se lavaron en PBS 2 veces, se pelletearon y se solubilizaron (en Tris 50 mM pH 7,4, EGTA 10 mM, NP-40 0,5% y cócteles de inhibidores de proteasas y fosfatasas). Las muestras se centrifugaron para eliminar el material insoluble y se alicuotaron. También se recogió sangre entera en tubos PAXgene para la expresión de genes de receptores de neuropéptidos. Las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 2 horas, posteriormente se transfirieron a - 20 °C durante 24 horas y luego se transfirieron a - 80 °C según las directrices del fabricante. Todas las muestras biológicas se almacenaron a - 80 °C hasta la cuantificación.


Tras la recogida de muestras, se administró profilácticamente a cada sujeto metoclopramida y ketoprofeno. Además, se administraron líquidos de reposición si era necesario según las directrices veterinarias. Los sujetos fueron colocados en una jaula de laboratorio estándar ubicada en una sala de hospitalización/transición para su recuperación durante la noche, y luego fueron devueltos a sus corrales de origen al día siguiente.



Cuantificación de neuropéptidos en LCR


Las concentraciones de OXT y AVP en el LCR se cuantificaron utilizando kits de inmunoensayo enzimático disponibles en el mercado (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) [41,42,43,44]. Estos kits han sido validados para su uso en monos rhesus y son altamente específicos y reconocen exclusivamente OXT y AVP, respectivamente, y no péptidos relacionados (es decir, la reactividad cruzada de OXT con AVP es < 0,02% y la sensibilidad mínima del ensayo es de 15 pg/mL; y la reactividad cruzada de AVP con OXT es < 0,001% y la sensibilidad mínima del ensayo es de 2,84 pg/mL). Un científico de investigación realizó la preparación de la muestra y la cuantificación de OXT y AVP siguiendo los procedimientos establecidos. Las muestras de LCR se analizaron directamente (sin extracción previa) para OXT y AVP. Todas las muestras de LCR se analizaron por duplicado (100 µl por pocillo) con un lector de microplacas sintonizable para formato de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante. Los coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo fueron 7,75% y 11,78%, respectivamente, para OXT. Los coeficientes de variación intra-ensayo e inter-ensayo fueron del 7,70% y 14,86%, respectivamente, para la AVP.



Cuantificación de receptores de neuropéptidos en sangre


La medición de los niveles de ARNm de OXTR y AVPR1A se llevó a cabo utilizando los protocolos desarrollados para los monos rhesus [41]. El ARN total fue aislado y purificado utilizando un kit de ARN sanguíneo PAXgene a partir de sangre estabilizada en tubos de ARN PAXgene (Qiagen, CA). La reacción de síntesis de ADNc de primera cadena se llevó a cabo con iScript Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad, CA) con una cantidad de ARN inicial de 1 µg en un volumen final de 20 µl. Se realizó la qPCR para determinar los niveles de expresión génica de OXTR y AVPR1A utilizando RT2 qPCR Primer Assays for Rhesus Macaque OXTR and AVPR1A (Qiagen, CA), y se utilizó el control endógeno (GAPDH, Life Technologies, CA) para la normalización. La qPCR se realizó en el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Applied Biosystems, CA) con SYBR Green (Qiagen, CA). El ADNc se amplificó por PCR por triplicado y los valores Ct de cada muestra se obtuvieron utilizando el software de qPCR QuantStudio 3. Los análisis se realizaron mediante el método Ct comparativo (2-ΔΔCt) [45].



Cuantificación de la señalización de las cinasas en sangre


Los niveles de activación de quinasas en sangre se determinaron utilizando protocolos previamente publicados [46], que habían sido optimizados para su uso en monos rhesus [41]. La proteína desnaturalizada (20 µg por carril) de la fracción citoplasmática soluble generada previamente se electroforizó a través de un gel de gradiente de poliacrilamida al 8-12% durante 2 h a 100 V a temperatura ambiente. El gel se electroblotó sobre una membrana de PVDF durante 1 h a 50 V a 4 °C. Tras el bloqueo, el blot se incubó con el anticuerpo primario (Ras, MEK1/2, fosfo-MEK1/2, Erk1/2, fosfo-Erk1/2, Pan AKT y fosfo-AKT, PTEN y fosfo-PTEN, y GAPDH, Cell Signaling, MA) durante una noche a 4 °C, se lavó y se siguió con la incubación del anticuerpo secundario fluorescente (Anti-Rabbit IgG, Cell Signaling, MA) durante 1 h a temperatura ambiente. Los blots se visualizaron utilizando el LI-COR Odyssey Imager (LI-COR Biosciences, NE).



Análisis estadísticos


Los datos se analizaron con JMP Pro 14 (SAS Institute Inc., Cary, NC). En primer lugar, se calculó la fiabilidad test-retest de los datos de la vía de señalización de neuropéptidos y quinasas como un coeficiente de correlación intraclase "Caso 2A" de consistencia estimado por un Modelo Mixto de Máxima Verosimilitud Restringido siguiendo [47]. Esto produce un tamaño del efecto equivalente a un coeficiente de correlación [47]. Como se ha indicado anteriormente, se recogieron tres muestras de un subconjunto de sujetos para este fin. Los sujetos se incluyeron en este análisis siempre que tuvieran al menos 2 de los 3 puntos temporales utilizables por medida biológica representados en los datos; todos los n = 43 monos cumplieron este umbral de inclusión.


A continuación, realizamos un análisis de componentes principales (PCA) para comprender mejor las posibles colinealidades entre las medidas biológicas fiables y su relación con la puntuación de la mSRS-R. Esto es fundamental para evitar que las colinealidades produzcan falsos negativos (o, menos probablemente, falsos positivos) en nuestro análisis final del Modelo Lineal General (GLM) (ver más abajo). Este enfoque es un ejemplo de las mejores prácticas de "análisis de sensibilidad" [48]. Dado que casi todas las medidas biológicas mostraron una alta fiabilidad test-retest, pudimos evaluar n = 57 sujetos que tenían un conjunto completo de medidas biológicas en el primer punto temporal de recogida. Los valores propios y los gráficos de dispersión sugirieron una solución de 3 componentes, que representaba el 69,1% de la varianza total. Ésta se extrajo mediante la rotación varimax para los componentes principales. Las cargas del PCA son tamaños de efecto equivalentes al coeficiente de correlación entre el componente y la variable [49].


Este PCA sugirió que la concentración de AVP en el LCR y la expresión génica diferencial de los receptores de neuropéptidos podrían predecir la puntuación de la mSRS-R, mientras que las otras medidas biológicas no parecían estar relacionadas (según las cargas de las variables). Para probar esta hipótesis, realizamos un GLM, prediciendo la puntuación de la mSRS-R, dadas las medidas biológicas fiables. El análisis controló por corral, cohorte, edad y rango. La expresión génica de OXTR y AVPR1A en sangre estaba altamente correlacionada y colineal con la expresión génica total y diferencial de los receptores de neuropéptidos. Por lo tanto, incluimos la expresión génica total de los receptores de neuropéptidos como la suma de la expresión génica de OXTR y AVPR1A para capturar la expresión correlacionada de los dos genes, y la expresión génica diferencial de los receptores de neuropéptidos como la diferencia entre la expresión génica de OXTR y AVPR1A para capturar la regulación relativa ascendente o descendente de estos receptores. Todas las demás medidas biológicas fiables se incluyeron en el análisis. Este enfoque prueba de forma conservadora cada medida biológica controlando todas las demás, y así identifica las variables que impulsan una relación mientras excluye las variables que sólo están correlacionadas de forma secundaria. Los supuestos del MLG (normalidad del error, homogeneidad de la varianza y linealidad) se probaron gráficamente. No se requirieron transformaciones. Como se indicó anteriormente, n = 57 sujetos tenían conjuntos de muestras biológicas completas disponibles en el primer punto de tiempo de recogida para el análisis. Sin embargo, la concentración de AVP en el LCR se había cuantificado en todos los N = 76 sujetos, y se disponía de un valor de AVP de n = 75 de ellos. Esto nos permitió realizar un análisis de seguimiento en toda la muestra del estudio excluyendo todas las medidas biológicas excepto la concentración de AVP en LCR, pero incluyendo todos los factores de bloqueo mencionados anteriormente, en el modelo.


Los métodos avanzados que se emplean aquí aumentan en gran medida la potencia y reducen el tamaño de la muestra (a menudo entre 5 y 10 veces) con respecto a análisis como las pruebas T o la regresión simple, al tiempo que reducen los falsos positivos [50,51,52,53,54]. Sin embargo, no existen cálculos formales de potencia a priori similares a los utilizados para análisis más sencillos para los análisis empleados aquí. Como hemos argumentado nosotros y otros [50, 55, 56], el mejor enfoque para los cálculos de potencia a priori para los análisis avanzados es la Ecuación de Recursos de Mead [57]. La Ecuación de Recursos de Mead proporciona un tamaño de muestra por encima del cual los sujetos adicionales tendrán poco impacto en la potencia; este tamaño era menor que el número de sujetos que teníamos disponibles para cada análisis. Por lo tanto, optamos por utilizar todos los sujetos de los que disponíamos de datos, observando que todos estos análisis tienen una potencia adecuada. Por último, los tamaños del efecto para estos análisis GLM se reportan como eta parcial al cuadrado (ηp2), que es el cuadrado del coeficiente de correlación parcial rp para los predictores continuos, siguiendo la mejor práctica para GLMs [50].




Resultados


Las medidas biológicas asociadas al autismo demuestran una sólida fiabilidad test-retest


Todas las medidas de señalización de neuropéptidos y quinasas (excepto AKT fosforilada / AKT total) mostraron una significativa fiabilidad test-retest dentro de los individuos a través de múltiples puntos de tiempo de recogida (Tabla 2). Los coeficientes de correlación intraclase de fiabilidad test-retest oscilaron entre el 42,0 y el 88,6% para las medidas biológicas fiables. Estas medidas abarcaron un periodo de recogida de 10 meses (incluyendo las temporadas de cría y de no cría) e indican que los cambios circadianos en el comportamiento de cría no afectan significativamente a la consistencia de estas medidas.


Tabla 2. Consistencia intraindividual de las medidas biológicas


(Véase, en inglés, en el siguiente enlace)