Evaluación del análisis de microarreglos cromosómicos en una gran cohorte de mujeres con autismo

Evaluación del análisis de microarreglos cromosómicos en una gran cohorte de mujeres con trastornos del espectro autista: un estudio italiano de un solo centro

POR SARA CALDERONI 1,2,*,†ORCID,IVANA RICCA 3,†,GIULIA BALBONI 4ORCID,ROMINA CAGIANO 1,DENISE CASSANDRINI 3,STEFANO DOCCINI 3ORCID,ANGELA COSENZA 1,DEBORAH TOLOMEO 3,5,RAFFAELLA TANCREDI 1,FILIPPO MARIA SANTORELLI 3 YFILIPPO MURATORI 1,2

1. Departamento de Neurociencia del Desarrollo, IRCCS Fondazione Stella Maris, Viale del Tirreno 331, Calambrone, 56128 Pisa, Italia

2. Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de Pisa, Via Savi, 10, 56126 Pisa, Italia

3. Medicina molecular, IRCCS Fondazione Stella Maris, via dei Giacinti 2, Calambrone, 56128 Pisa, Italia

4. Departamento de Filosofía, Ciencias Sociales y Humanas y Educación, Universidad de Perugia, Piazza G. Ermini 1, 06123 Perugia, Italia

5. Departamento de Neurociencias, Psicología, Investigación de Drogas y Salud Infantil (NEUROFARBA), Universidad de Florencia, Viale Pieraccini, 6-50139 Florencia, Italia

*Autor al que debe dirigirse la correspondencia.

†

Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

J. Pers. Med. 2020, 10(4), 160; https://doi.org/10.3390/jpm10040160

Recibido: 7 de septiembre de 2020 / Revisado: 20 de septiembre de 2020 / Aceptado: 21 de septiembre de 2020 / Publicado: 9 de octubre de 2020

(Este artículo pertenece al número especial Un enfoque de medicina personalizada para el diagnóstico y el manejo del TEA)

MDPI and ACS Style

Calderoni, S.; Ricca, I.; Balboni, G.; Cagiano, R.; Cassandrini, D.; Doccini, S.; Cosenza, A.; Tolomeo, D.; Tancredi, R.; Santorelli, F.M.; Muratori, F. Evaluation of Chromosome Microarray Analysis in a Large Cohort of Females with Autism Spectrum Disorders: A Single Center Italian Study. J. Pers. Med. 2020, 10, 160.

Resumen

Los trastornos del espectro autista (TEA) abarcan un grupo heterogéneo de trastornos del desarrollo neurológico resultantes de la compleja interacción entre los factores genéticos y ambientales. Gracias al análisis de microarreglos cromosómicos (CMA) en la práctica clínica, fue posible identificar y caracterizar con precisión las deleciones/duplicados submicroscópicos (variantes del número de copias, CNV) asociados a los TEA. Sin embargo, el exceso ampliamente reconocido de hombres en el espectro del autismo refleja la escasez de estudios de AMC centrados específicamente en mujeres con TEA (f-ASD). En este marco, nuestro objetivo es evaluar la frecuencia de las VNC causantes en una cohorte unicéntrica de f-ASD idiopática. Entre los 90 f-ASD analizados, encontramos 20 pacientes con una o dos VNC potencialmente patógenas, incluyendo aquellas previamente asociadas a la TEA (localizadas en las regiones 16p13.2 16p11.2, 15q11.2, y 22q11.21). Un análisis exploratorio de genotipo/fenotipo reveló que la f-ASD con VNC causantes tenía conductas restrictivas y repetitivas estadísticamente significativas más bajas que las de aquellos sin VNC o con VNC no causantes. El trabajo futuro debería centrarse en una mayor comprensión de los fundamentos genéticos de la f-ASD, aprovechando las tecnologías de secuenciación de última generación, con el objetivo final de contribuir a la medicina de precisión en la TEA.

Palabras clave: trastornos del espectro autista; variantes del número de copias; hembras; Hibridación Genómica Comparativa (Array-CGH)

1. Introducción

Los trastornos del espectro autista (TEA) son un grupo heterogéneo de patologías del desarrollo neurológico caracterizadas por anomalías de aparición temprana en la comunicación e interacción social, así como por conductas e intereses atípicamente restringidos y repetitivos [1]. A pesar de que la patogénesis exacta de la TEA idiopática aún no se ha dilucidado completamente, pruebas recientes sugieren una interacción entre la responsabilidad genética y las influencias ambientales para producir una alteración temprana del desarrollo del cerebro [2]. En particular, entre los factores de riesgo ambientales, varios factores maternos (incluyendo la edad ≥ 35 años, hipertensión crónica, preeclampsia, hipertensión gestacional, y sobrepeso antes o durante el embarazo) se asociaron con la TEA en una revisión actualizada de la literatura [3]. Los datos actualizados sobre la prevalencia de TEA en los Estados Unidos (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, CDC [4]) identificaron que 1 de cada 54 niños tiene TEA, mientras que la prevalencia estimada de TEA en la población italiana es de 1 de cada 87, según una investigación reciente [5].

Crucialmente, desde las primeras descripciones del autismo [6,7], se ha observado consistentemente un fuerte sesgo masculino en la prevalencia de TEA, que se hace aún más pronunciado en los individuos sin discapacidad intelectual, según datos de los años 80 [8,9]. Estudios más recientes han cuestionado esta afirmación, sugiriendo que los diagnósticos erróneos o perdidos de las mujeres con TEA, especialmente de aquellas con buenas habilidades intelectuales y de lenguaje, contribuyen a la proporción sesgada de sexo en los TEA [10].

Los mecanismos exactos que subyacen a la vulnerabilidad masculina o la protección femenina en los TEA siguen siendo complejos y apenas se han investigado. Se ha propuesto un modelo multifactorial en el que una mezcla de variantes genéticas y factores ambientales contribuyen a la responsabilidad, posiblemente interactuando con vías específicas del sexo como las relacionadas con las hormonas o la función inmunológica [11,12].

Las investigaciones genéticas en el TEA revelaron con frecuencia resultados sexualmente dimórficos. Por ejemplo, se ha observado un mayor número de variantes del número de copias (CNV) de novo [13,14,15,16] así como una mayor tasa de variantes de nucleótidos simples (SNV) de novo encontradas en secuencias de exomas [17,18] en mujeres con TEA (f-ASD) que, en los hombres, especialmente en el sitio de no-sentido y empalme [19,20]. Por el contrario, un estudio más reciente señaló mutaciones específicas del sexo, específicamente en el cromosoma X, que pueden contribuir a la prevalencia masculina en la TEA [21]. Por otro lado, en lo que respecta a las diferencias de sexo en los perfiles de los síntomas, algunos estudios previos sugirieron características fenotípicas diferentes en las mujeres que en los hombres con TEA [22], como un coeficiente intelectual más bajo [23], un funcionamiento social y/o comunicativo más deteriorado [24], problemas psicopatológicos [25] y conductas restringidas y repetitivas más leves [26,27,28]. Sin embargo, este tema sigue siendo controvertido [29,30,31,32,33]. Las mujeres con TEA también mostraron una mayor tasa de condiciones neurológicas co-ocurrentes que los hombres con TEA, es decir, microcefalia, regresión del desarrollo en la socialización, déficits menores neurológicos y musculoesqueléticos [34], y epilepsia [35], todos apuntando a diferencias de sexo en los antecedentes genéticos.

El advenimiento del análisis de microarreglos cromosómicos (CMA) en la práctica clínica [36] permite una rápida detección y una caracterización precisa de las deleciones y duplicaciones submicroscópicas (CNV) del ADN genómico asociado a la CIA [37,38]. Las sociedades de aprendizaje y los expertos en TEA recomiendan el AMC como parte de la evaluación de primera línea para los individuos con TEA [39,40,41]. Sin embargo, la AMC trae a colación un nivel más alto de reordenamientos genómicos polimórficos y el proceso para atribuir causalidad en condiciones complejas como la TEA no es fácil ni sencillo.

Este estudio tiene por objeto investigar la frecuencia de las VNC causales en una cohorte de f-ASD idiopática transversal de un solo centro para delinear posibles asociaciones de genotipo/fenotipo.

2. Métodos

Recogimos los datos clínicos de un grupo de 93 mujeres remitidas consecutivamente a la Unidad de Trastornos del Espectro de Autismo de nuestro Hospital Neuropsiquiátrico Infantil entre 2015 y 2016. La edad de la última evaluación clínica osciló entre 21 meses y 17 años. Todos los participantes recibieron un diagnóstico clínico de TEA basado en los criterios del Manual Diagnóstico y Estadístico de Trastornos Mentales (DSM-5) [1]. Todos los pacientes no estaban relacionados.

De acuerdo con nuestro protocolo de detección de TEA, se investigaron las condiciones neurometabólicas y la lesión hipóxica-isquémica. Todos los participantes fueron evaluados por un experto genetista clínico para excluir los síndromes monogénicos reconocibles. Antes de este estudio, cada individuo también había sido probado para las secuencias de repetición expandida en 5′-UTR del gen FMR1 como se informó anteriormente [42].

Basándonos en este examen, excluimos dos mujeres con un historial de hipoxia perinatal y enfermedad de la materia blanca difusa detectada en la resonancia magnética del cerebro (MRI), y un paciente con macrocefalia que albergaba una mutación patógena en el PTEN. En un solo caso (paciente P11) analizamos las VNC a pesar de que presentaba un mosaicismo somático de bajo nivel para un alelo FMR1 completamente mutado/pre-mutado, porque el fenotipo de la paciente no podía explicarse completamente por esta condición genética.

Por lo tanto, examinamos a 90 individuos femeninos con ASD para detectar VNC. Los participantes fueron clasificados como clínicamente afectados por el autismo "esencial", basado en la ausencia de anormalidades congénitas mayores y dismorfismo mayor [43,44].

La evaluación cognitiva se realizó en 87 participantes con escalas cognitivas específicas basadas en la edad y el nivel de lenguaje. De acuerdo con la edad, los niños fueron evaluados respectivamente con la Escala de Desarrollo Mental de Griffiths-Revisada (GMDS-R) [45], la Escala de Inteligencia para Preescolar y Primaria de Wechsler - tercera edición (WPPSI, III) [46] o la Escala de Inteligencia para Niños-IV de Wechsler (WISC, IV) [47]. La evaluación de las mujeres no verbales se realizó utilizando la Escala Internacional de Desempeño Revisada de Leiter (Leiter-R) [48]. En tres participantes, la evaluación cognitiva no se realizó debido al escaso cumplimiento debido a los graves síntomas de autismo.

La evaluación clínica de las habilidades lingüísticas expresivas definió a las mujeres con una ausencia total de lenguaje (n = 27) y un grupo de f-ASD "verbal" (n = 63).

La evaluación semiestructurada del Programa de Observación Diagnóstica del Autismo, segunda edición (ADOS-2) [49], que proporciona una medida de la gravedad del autismo, estuvo disponible en 67 participantes. Registramos la puntuación en los dominios de Afecto Social (SA) y de Comportamientos Restringidos y Repetitivos (RRB) para cada probando. Dado que utilizamos diferentes módulos de ADOS según el nivel de lenguaje expresivo no ecléctico de cada paciente en el momento de la evaluación, convertimos las puntuaciones globales de ADOS y las subpuntuaciones de los dominios SA y RRB en la correspondiente Puntuación Calibrada de Gravedad (CSS) [50,51].

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Pediátrica de la Región Toscana (Italia), y se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y sus posteriores enmiendas o normas éticas comparables. Todos los padres o representantes legales firmaron un formulario de consentimiento informado antes de la inclusión de su hijo en el estudio. Se omitieron las identidades de todos los individuos.

3. Procedimiento

3.1. Análisis genético

Los análisis de AMC se realizaron utilizando la plataforma de oligonucleótidos Agilent 8 × 60 K Microarray con una resolución media de 100 Kbp, de acuerdo con el protocolo de fabricación (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Las coordenadas de la CNV se refieren al Consorcio de Referencia del Genoma Humano Build 37 (GRCh37/hg19).

En cada probando, las CNV fueron confirmadas por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Los análisis de segregación en el ADN de los padres (cuando estaban disponibles) se realizaron mediante qPCR. Se filtraron las VNC polimórficas, basadas en los datos de la Base de Datos de Variantes Genómicas (DGV) [52]).

Las VNC no polimórficas se clasificaron como "causales" (C-CNV) o "no causales" (N-CNV) según las directrices del Colegio Americano de Genética Médica y Genómica (ACMG) [53]. Consideramos como "causal": i) Las VNC que abarcan regiones genómicas o genes asociados con la enfermedad del espectro autista o con otras afecciones neuropsiquiátricas (es decir, discapacidad intelectual, epilepsia y esquizofrenia) en la base de datos de la Herencia Mendeliana en el Hombre (OMIM) [54]; ii) VNC que contienen genes de "alta confianza" de TEA reportados en la base de datos de genes de la Iniciativa de Investigación del Autismo de la Fundación Simons (SFARI) [55] con una puntuación < 3 o en la Base de Conocimientos sobre el Autismo versión 2. 0 (Autism KB 2.0) [56] con una puntuación > 16; (iii) VNC que incluyen "genes candidatos" para el TEA, ya sea que se hayan reportado en asociación con el autismo en la literatura, o que estén listados en las bases de datos mencionadas anteriormente y con una puntuación del gen SFARI ≥ 3 o una puntuación de Autism KB ≤ 16 (genes candidatos sugestivos o de "baja confianza"). Por el contrario, las VNC se consideraron no causativas (VNC) si nunca se han asociado con el TEA u otros trastornos del desarrollo neurológico (TND). Los pacientes que resultaron negativos para las VNC fueron clasificados como "sin VNC" (w-CNV).

Para reconocer los módulos funcionales significativamente enriquecidos, los genes candidatos a la TEA englobados en las VNC se evaluaron mediante herramientas bioinformáticas. Un análisis de núcleo ejecutado en el modo de análisis de efectos de variantes mediante el uso del software de análisis de vías de ingenio (IPA) [57] descubrió los procesos celulares relacionados con nuestro conjunto de datos de genes (21 genes). Se generó una red funcional que abarca nuestros genes candidatos a ASD. Los nodos puente se denominaron evaluando las interacciones directas e indirectas con un riguroso nivel de confianza y sólo relacionadas con enfermedades neurológicas. La categorización de la ontología genética (GO) se llevó a cabo utilizando ToppGene Suite [58]. Las tres ontologías principales para las funciones moleculares y el componente celular fueron anotadas y la significación estadística de los términos GO fue reportada como -log10 (valor p).

3.2. Análisis estadísticos

Utilizamos una prueba de chi-cuadrado para investigar la asociación entre el subtipo de VNC y el tipo de VNC (duplicación o eliminación) y el patrón de herencia (de novo o hereditario, paterno o materno). Se utilizó una prueba de Mann-Whitney para verificar si existían diferencias en la carga de VNC de los distintos subtipos de VNC (excluyendo al paciente P23 que llevaba una duplicación completa del cromosoma X).

También investigamos el fenotipo de los individuos con los diferentes subtipos de VNC probando con la prueba de ji-cuadrado la asociación entre el subtipo de VNC y los niveles cognitivos (IQ ≤ 70 vs. >70) y de lenguaje (no verbal vs. verbal). Se utilizó una prueba de Mann-Whitney para determinar que los grupos con diferentes subtipos de VNC se correspondían con la edad y para verificar si existían diferencias en la puntuación de CCS obtenida en el total de ADOS y en sus dominios AS y RRB. En caso de diferencias estadísticamente significativas, calculamos la puntuación r como índice del tamaño del efecto. Esto se interpretó como insignificante (r < 0,10), pequeño (0,10 ≤ r < 0,30), medio (0,30 ≤ r < 0,50), o grande (r ≥ 0,50).

4. Resultados

4.1. Análisis de microarreglos cromosómicos (CMA)

Realizamos la AMC en 90 mujeres afectadas por TEA idiopática, detectando 35 VNC (17 duplicaciones y 18 supresiones) en 29 (32,2%). Veintitrés participantes tenían una VNC y seis presentaban 2 desequilibrios. Sesenta y un f-ASD se consideraron con VNC (67,8% de todo el grupo).

De 35 VNC, 25 fueron clasificados C-CNVS (71,4%) y 10 N-CNVs (28,6%). En todo el grupo de 90 f-ASD, 20 pacientes albergaron al menos una VNC posible causante de enfermedad (rendimiento diagnóstico 22,2%) (Figura 1).

Figura 1. Representación gráfica de los resultados del análisis de microarreglos cromosómicos (CMA) en nuestro grupo de 90 mujeres afectadas por el autismo. En el gráfico circular se representa el porcentaje de individuos con variantes de número de copias causales (C-CNVs), variantes de número de copias no causales (N-CNVs) o sin variantes de número de copias (w-CNVs).

En la tabla 1 se ilustran los resultados de las investigaciones de la AMC. No hubo C-CNVs recurrentes, con la excepción de dos sujetos no relacionados que albergaron una microduplicación 15q11-q13. Diez VNC implicaban regiones genómicas ya asociadas a síndromes conocidos de supresión/duplicación de genes contiguos asociados a la TEA o a las END, cinco VNC abarcaban genes de TEA "de alta confianza" y diez genes implicados reportados en la literatura o en las bases de datos de Gene/Autism KB del SFARI como posibles candidatos al autismo.

(véase tabla 1 en inglés)

https://www.mdpi.com/2075-4426/10/4/160/htm

En la tabla 2 se resumen la función y las pruebas de la posible asociación con enfermedades de los genes candidatos notificados. El análisis bioinformático mostró que 11 de los 21 genes candidatos y asociados a enfermedades reportados están involucrados en la estructura sináptica y la transmisión (ADARB1, ASIC2, CADM2, DMD, GRIN2A, GRM7, NEDD4, NRXN1, PCDH15, PTPRD, TRPM2) (Figura 2).

Figura 2. Análisis bioinformáticos realizados en los genes candidatos a la TEA englobados en los C-CNV. (A) Un análisis básico ejecutado en el modo de análisis de efectos de variantes utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis descubrió procesos celulares relacionados con nuestro conjunto de datos de genes (21 genes) generando una red funcional que abarca 11 genes (en rojo). La transmisión sináptica resultó ser la anotación funcional más significativa (valor p 6,05 × 10-9). Los nodos puente (en blanco) se denotaron evaluando tanto las interacciones directas como las indirectas relacionadas únicamente con las enfermedades neurológicas y con un riguroso nivel de confianza (B). La categorización de la ontología génica (GO) se llevó a cabo utilizando ToppGene Suite. Se anotaron las tres ontologías principales para la función molecular (gris oscuro) y el componente celular (gris claro); la significación estadística de los términos GO se informó como -log10 (valor p). El número de genes pertenecientes a cada categoría se informó a la derecha de cada barra.

Tabla 2. Función y evidencias de la asociación de enfermedades de los genes candidatos reportados englobados en las variantes de número de copias (CNV) causales. La tabla informa de evidencias que apoyan el posible papel en el autismo de los genes del trastorno del espectro autista (TEA) de "alta confianza" reportados (genes con una puntuación del gen SFARI de la Iniciativa de Investigación del Autismo de la Fundación Simons < 3 o con una puntuación de KB 2.0 de autismo > 16), y genes candidatos sugestivos o de "baja confianza" (genes con una puntuación del gen SFARI ≥ 3 o con una puntuación de AutismoKB 2.0 ≤ 16). Para cada gen, se informa la región genómica, la identificación del participante, la función de la proteína codificada y las puntuaciones asignadas en las bases de datos de los genes SFARI y AutismKB 2.0 (NR: gen no informado en la base de datos).

(véase tabla 2 en inglés)

https://www.mdpi.com/2075-4426/10/4/160/htm

En el 24 f-ASD, con 29 VNC, evaluamos un origen de novo en 8 y uno paterno en 12, mientras que los VNC fueron heredados por la madre en 9 pacientes. En 5 niños no pudimos evaluar la segregación por falta de ADN paterno. El cuadro 3 muestra la proporción de duplicaciones y supresiones y el modo de herencia en relación con los diferentes subtipos de VNC. En general, la tasa de VNC de novo fue del 9,4%. Todas las VNC de novo implicaban genes/regiones cromosómicas asociadas con el trastorno neurológico. Las VNC que incluían genes de la ASD sugestivos o de "baja confianza" eran todas hereditarias; 6 de cada 9 alteraban más de un gen de la ASD o estaban asociadas a una VNC adicional. Siete de 9 heredadas por la madre vs. 6 de 12 heredadas por el padre fueron causales.

Tabla 3. Proporción de deleciones vs. duplicaciones y patrón de herencia de las VNC reportadas de acuerdo a su clasificación (causales vs. no causales).

(véase tabla 3 en inglés)

https://www.mdpi.com/2075-4426/10/4/160/htm

4.2. Caracterización fenotípica

Veintisiete f-ASD tenían una ausencia de lenguaje mientras que 63 eran "verbales".

La evaluación cognitiva se realizó en 87 participantes, siendo tres participantes no aptos para la prueba psicométrica. Cuarenta y dos de los individuos evaluados tenían un coeficiente intelectual ≤ 70 y 45 tenían un coeficiente intelectual ≥ 70.

Los 67 participantes probados con ADOS-2 tuvieron la siguiente media (SD) Total, SA y RRB ADOS CSS, respectivamente: 6,57 (2,36), 6,79 (2,34) y 7,22 (2,30).

La tabla suplementaria S1 recapitula los datos clínicos de la población estudiada.

4.3. Análisis estadístico

Observamos una asociación estadísticamente significativa entre la herencia (de novo vs. maternal y paterna) y los subtipos de VNC (C-CNV vs. N-CNV) (Chi2(1) = 4.21, p = 0.04). De hecho, todas las N-CNVs fueron transmitidas y nunca surgieron de novo mientras que todas las CNVs de novo fueron causales (38% de las C-CNVs); 7 de 9 (77.8%) C-CNVs fueron maternas y 6 de 12 (50%) fueron paternas.

Si bien el tipo de microarreglos genómicos (deleción vs. duplicación) no se correlacionó estadísticamente con la definición de causante/no causante (Chi2(1) = 0,41, p = 0,52), sin considerar las VNC asociadas a síndromes de genes contiguos, la mayoría de los puntos de ruptura de las duplicaciones causantes se encuentran dentro de al menos un gen candidato a la enfermedad de Newcastle (n = 6/8). Las VCN-C tenían un valor de carga de VNC significativamente mayor que las de los subtipos de VCN-ND (media (SD) = 1,14 (1,43) frente a 0,19 (0,16); Mann-Whitney U = 52,50, z = 2,56, p = 0,01, r = 0,49).

La tabla 4 muestra la edad, el nivel cognitivo y lingüístico, así como la gravedad del autismo de los tres grupos de individuos según los diferentes subtipos de VNC (causal, no causal y sin VNC).

Tabla 4. Características demográficas de los participantes agrupados según los resultados de la AMC. Para cada grupo (con VNC causales y no causales, o sin VNC) se informa la edad media en el último examen (en meses), la tasa de pacientes con un nivel de CI > 70 vs. ≤70, la tasa de pacientes verbales vs. no verbales, y las puntuaciones medias de gravedad calibrada (CSS) de las puntuaciones globales del Programa de Observación Diagnóstica del Autismo (ADOS) y las subpuntuaciones de los dominios de Afecto Social (SA) y Comportamientos Restringidos y Repetitivos (RRB). Se evaluó el nivel de lenguaje en los 90 participantes, el nivel de coeficiente intelectual y las puntuaciones ADOS estaban disponibles para 87 y 67 de los 90 individuos, respectivamente.

(véase tabla 4 en inglés)

https://www.mdpi.com/2075-4426/10/4/160/htm

Para investigar si había diferencias significativas en las características clínicas entre los grupos, reagrupamos a los participantes con resultados negativos de AMC (N-CNV y w-CNV) y comparamos sus características con los casos con C-CNV. Los dos grupos resultaron coincidentes en cuanto a la edad [media (SD) = 66,95 (38,55) vs. 56,74 (38,03); Mann-Whitney U = 523,00, z = 1,72, p = 0,09].

Encontramos que no había diferencias entre los dos grupos a nivel cognitivo (IQ ≤ 70 vs. IQ > 70; Chi2(1) = 0.47, p = 0.49), a nivel de lenguaje (no verbal vs. verbal; Chi2(1) = 0. 31, p = 0,58), y en el CSS obtenido en la puntuación total y en el dominio AS ADOS (Mann-Whitney U = 262,50, z = 1,42, p = 0,16; Mann-Whitney U = 303,00, z = 0,77, p = 0,44).

Las frecuencias relativas de los rasgos fenotípicos fueron las siguientes: en el grupo con C-CNV, el 55% (11/20) tenía un coeficiente intelectual (IQ) ≤ 70; el 60% tenía un nivel moderado-severo de síntomas de autismo (9/15), el 35% tenía ausencia de lenguaje (7/20); en el grupo con CMA negativo, el 46% (31/37) tenía un coeficiente intelectual (IQ) ≤ 70; el 75% tenía un nivel moderado-severo de síntomas de autismo (47/62), el 28% tenía ausencia de lenguaje (20/70).

Por el contrario, encontramos que el f-ASD con C-CNVs tenía un CSS estadísticamente significativo más bajo en el dominio RRB ADOS que los que no tenían CNVs o con no causativo (media (SD) = 6.08 (2.14) vs. 7.50 (2.27); Mann-Whitney U = 197, z = 2.48, p = 0.01, r = 0.30).

5. Discusión

Aunque un reciente meta-análisis y una declaración de consenso multidisciplinario propone la secuenciación exome al comienzo de la evaluación de trastornos inexplicables del desarrollo neurológico [73], la AMC sigue siendo el análisis genético de primer nivel recomendado en la evaluación de los sujetos con TEA [40,74].

En los últimos años, las investigaciones de grandes cohortes de individuos con TEA [13,37,75] han identificado una alta carga de VNC con VNC poco comunes que se encuentran en el 5-10% de los TEA idiopáticos [76]. Sin embargo, estos datos se ven a menudo afectados por prejuicios de género debido a la alta proporción de M/F en la gran mayoría de los estudios, e incluso investigaciones más recientes que abordan el tipo y la frecuencia de las C-CNV no permitieron -con pocas excepciones- realizar exámenes de género por separado debido al tamaño relativamente pequeño de la muestra [77,78,79,80].

Aquí nos enfocamos exclusivamente en una cohorte de f-ASD y encontramos VNC clínicamente significativas en cerca del 22% de los pacientes. Pocas investigaciones han considerado las VNC y las características clínicas en f-ASD en comparación con los hombres con TEA. En un estudio, las VNC grandes (>400 kb) fueron más frecuentes en f-ASD que en los varones (29% vs. 16%), y esta diferencia fue aún mayor (F/M 3:1) si los análisis se limitaron a las regiones que contienen genes involucrados en las END [81]. En un sentido similar, Levy y sus colegas (2011) [13] detectaron que los f-ASD tienen una alta frecuencia de VNC de novo (11,7% vs. 7,4% en los varones), y Sanders y otros (2015) [15] identificaron una diferencia significativa en la tasa de VNC de novo entre los niños (5,3%) y las niñas (8,7%). Nuestros números en un estudio monocéntrico transversal de sólo niñas denotan un efecto sexual similar con un alto rendimiento diagnóstico y una ocurrencia del 9,4% de variantes de novo.

Todas las VNC de novo implicaban regiones cromosómicas conocidas asociadas a NDD, mientras que las VNC que incluían genes de ASD sugestivos o de "baja confianza" eran todas heredadas y en su mayoría alteraban más de un gen de NDD o estaban asociadas a un C-CNV adicional. Entre las VNC-C, había un exceso de VNC potencialmente patógenas heredadas por la madre. Estos hallazgos apoyan el "modelo de dos aciertos" sugerido en estudios previos en los que el efecto compuesto de un pequeño número de variantes raras puede contribuir a la heterogeneidad fenotípica de la TEA [82].

Si bien la literatura en el campo de la TEA informó de un exceso de supresiones clínicamente significativas, no encontramos una correlación entre el tipo de reordenamiento genómico y la definición causal/no causal. La haploinsuficiencia de los genes dentro de una deleción es una causa bien reconocida de enfermedad genética. Por el contrario, la interpretación de las consecuencias fenotípicas de las microduplicaciones suele ser difícil porque la patogenicidad de la mayoría de las duplicaciones no puede explicarse por la triplosensibilidad. Al secuenciar los puntos de ruptura de 119 duplicaciones, Newman y otros (2015) demostraron que, más que un efecto de copia adicional, el fenotipo de las microduplicaciones puede estar relacionado con la regulación errónea de los genes que abarcan los puntos de ruptura, mediante mecanismos de pérdida de función debido a la alteración de la transcripción o la traducción o a la creación de proteínas de fusión con funciones desconocidas [83]. En nuestra cohorte f-ASD, la mayoría de los puntos de ruptura de las duplicaciones no sindrómicas causantes interrumpieron al menos un gen candidato a NDD, por lo que podemos suponer que el fenotipo patógeno podría ser causado por mecanismos similares.

A diferencia de los resultados de la literatura anterior [78], no encontramos ninguna asociación entre los C-CNV y el coeficiente intelectual o los déficits del lenguaje. Analizando las características fenotípicas de las mujeres con C-CNVs versus aquellas con resultados negativos de CMA, sólo observamos puntuaciones estadísticamente significativas más bajas en el dominio ADOS de conductas repetitivas restringidas (RRB) en f-ASD con variantes clínicamente significativas. Recientemente, Barone y otros informaron de síntomas autistas más graves en individuos con VNCC [79]. Las discrepancias con nuestros datos podrían reflejar las diversas características de la población estudiada, de hecho, varios estudios sugirieron un efecto del sexo en las puntuaciones de RRB, que se informa que son repetidamente más bajas en los subgrupos femeninos que en los masculinos [28,84,85,86]. De manera crucial, varias líneas de evidencia sugieren que los dominios de los síntomas de la comunicación social (SC) y la RRB están apuntalados por diferentes mecanismos genéticos. Por ejemplo, un reciente estudio de asociación del genoma completo demostró que el rasgo "sistematizante" de la RRB es hereditario y está genéticamente correlacionado con el autismo en la población general y que los dominios SC y RRB en los sujetos autistas muestran una baja genética compartida [87]. En particular, la contribución de los factores genéticos al dominio RRB se sustenta en su significativa presencia en ambos padres [88] y hermanos [89] de los probandos con TEA. En general, el impacto de las VNC en los síntomas de la TEA todavía no está claro y un trabajo reciente destacó la contribución de los factores ambientales (es decir, las infecciones maternas durante el embarazo) en la gravedad de la BRC en los individuos con VNC [90]. Sólo podemos especular que registramos menores puntuaciones de RRB en nuestra f-ASD con resultados positivos de CMA porque esta muestra representa el extremo leve de un trastorno genómico "simple", mientras que las niñas con resultados negativos podrían reflejar el grupo de f-ASD con etiología multifactorial "compleja", como la mayor parte de los varones autistas idiopáticos.

Con la excepción de dos sujetos con una microduplicación de 15q11-q13, no se detectaron VNC superpuestas, lo que confirma la alta heterogeneidad genética de los TEA. Quince VNC correspondían a genes o regiones genómicas ya identificados asociados a la TEA/NDD, mientras que 10 VNC correspondían a genes considerados como posibles candidatos a la TEA en la literatura o en las bases de datos de la TEA (cuadro 1 y cuadro 2). La contribución de cada VNC al fenotipo de nuestros pacientes con TEA-F se discute en el archivo suplementario S1. Fuera de esta lista, algunos casos parecen valer la pena ser discutidos.

Los síndromes de supresión/duplicación de genes contiguos conocidos que se detectaron en nuestros casos se asociaron con un diagnóstico de TEA "idiopática" porque estos pacientes no mostraron ninguna de las características adicionales no específicas del desarrollo neurológico de estos síndromes, como dismorfismos o defectos congénitos que pueden verse en los síndromes de Smith-Magenis (P8), microdeleción 17q12 (P10), supresión 2p15p16 (P19), duplicación 22q11 (P28) y duplicación SHOX (P29). Estos pacientes podrían representar el extremo leve del espectro fenotípico de estos trastornos genómicos, debido al "efecto protector de las enfermedades neurodegenerativas" que se observa en las mujeres [16].

En algunos casos, el fenotipado inverso permitió investigar y prevenir comorbilidades importantes, como en el P25, que lleva una duplicación parcial de novo del gen DMD, que en las mujeres podría manifestarse con debilidad muscular y cardiomiopatía, y en el P20, que lleva una duplicación de 16p11.2 ampliamente reportada en estudios de TEA que se asocia con el riesgo de desarrollar síntomas psicóticos [91].

Entre los reordenamientos de importancia clínica, se identificó la aneuploidía en un solo sujeto, que presentaba una trisomía del cromosoma X (47, XXX). Curiosamente, los datos que figuran en la bibliografía no indicaban un mayor riesgo de autismo en la trisomía del cromosoma X [92], aunque se describen dificultades en el funcionamiento social y, en términos más generales, una mayor vulnerabilidad a los rasgos autistas [68].

La duplicación de novo 16p13 detectada en un paciente (P3) involucra parcialmente a UPS7. Las variantes que afectan a este gen fueron reportadas recientemente en 23 individuos con retraso en el desarrollo sindrómico/discapacidad intelectual [93], y cerca de la mitad de los sujetos reportados tenían TEA. P3 presenta un leve retraso en el desarrollo motor, ausencia de habla, anomalías de comportamiento y TEA, lo que sugiere que se debe sospechar de la haploinsuficiencia de la UPS7 en un caso de TEA con ausencia de trastornos del habla y del comportamiento. Las VNC detectadas en los tramos del P3 también son GRIN2A y RBFOX1, por lo que no podemos excluir un posible papel adicional de estos genes en el fenotipo del paciente.

Las deleciones encontradas en P11, P14 y P15 refuerzan la evidencia de una posible contribución de los genes PCDH15, GRM7, CADM2 e IMMP2L a la susceptibilidad de la TEA.

Por último, cinco CNV abarcaron algunos genes de la ASD de "baja confianza", que pueden ser investigados en futuros estudios (por ejemplo, TRPM2, ADARB1, RFX7, NEDD4, ASIC2, PTPRD, ST6GAL2).

Cuando se combinaron los genes nuevos y viejos señalados por los estudios de AMC en módulos funcionales utilizando IPA y ToppGene Suite, se observó un enriquecimiento de los genes implicados en la función sináptica y la transmisión, que son procesos biológicos bien establecidos implicados en el autismo y las enfermedades neurológicas [94].

En conclusión, este estudio proporciona un cuadro representativo del espectro de VNC en f-ASD investigado en un entorno clínico. Como era de esperar, no se ha encontrado ninguna VNC específica que sea necesaria para el desarrollo de la TEA, lo que apoya la heterogeneidad de las vías moleculares afectadas. Sin embargo, los genes de las VNC en C de nuestra muestra de código f-ASD se refieren principalmente a proteínas que podrían agruparse en dos sistemas funcionales diferentes: función/estructura sináptica y procesamiento de ARNm/proteínas. Cabe destacar que las exposiciones ambientales durante ventanas específicas de vulnerabilidades en la vida prenatal y perinatal interactúan críticamente con la susceptibilidad genética contribuyendo a la patogénesis de la ASD [95]. Nuestro estudio sugiere que las mujeres con TEA idiopática tienen una alta tasa de VNC patógena que abarca tanto los genes de TEA conocidos como los nuevos candidatos. Por lo tanto, los estudios en grandes muestras de TEA f cuidadosamente evaluadas desde un punto de vista clínico podrían ayudar a desentrañar los determinantes genéticos del autismo. Además, el f-ASD con un análisis comparativo de hibridación genómica en serie normal podría beneficiarse de la secuenciación del exoma completo o del genoma [96], preparando el camino para la aplicación de tratamientos personalizados basados en los hallazgos genéticos.

Materiales complementarios

Los siguientes documentos están disponibles en línea en https://www.mdpi.com/2075-4426/10/4/160/s1, Cuadro S1: Características fenotípicas de los participantes; Archivo complementario S1: Contribución de cada CNV al fenotipo de los pacientes con enfermedad de Alzheimer.

Aportaciones del autor

Conceptualización del artículo, S.C., I.R., G.B., F.M.S., F.M.; Principales colaboradores en la redacción del manuscrito, S.C., I.R.; Recolección de muestras y caracterización clínica de los pacientes, A.C., R.T.; Adquisición de datos, R.C., D.T.; Análisis estadísticos, G.B.; Análisis genéticos, D.C., S.D.; Contribución a la revisión y edición del manuscrito, F.M.S., F.M. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación

Esta labor se ha financiado en parte con una subvención de la Fondazione Stella Maris del IRCCS (Ricerca Corrente, y las contribuciones voluntarias "5 × 1000" del Ministerio de Salud de Italia). S.C. fue parcialmente financiado por AIMS-2-Trials.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los sujetos que han participado en el estudio.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Declaración ética

El estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Pediátrica de la Región Toscana.

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J. Pers. Med., EISSN 2075-4426, Published by MDPI AG