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La microscopía mash-up cuantifica y mapea los circuitos neuronales


Autodetección: Una herramienta informática utiliza la inteligencia artificial para identificar sitios presinápticos en imágenes de neuronas.



POR NIKO MCCARTY

Fuente: Spectrum | 07/12/2022

Fotografía: Spectrum



La combinación de dos métodos de microscopía y una herramienta computacional permite a los investigadores cuantificar con rapidez y precisión las conexiones neuronales de cada animal


Según un nuevo estudio, la combinación de dos métodos de microscopía y una herramienta computacional permite a los investigadores cuantificar con rapidez y precisión las conexiones neuronales de cada animal. Esta técnica podría agilizar la cartografía de los conectomas de modelos de ratón autistas y determinar cómo las mutaciones en genes asociados al autismo modifican los circuitos neuronales.


Una neurona humana tiene miles de conexiones sinápticas que la microscopía óptica carece de resolución para detectar. La microscopía electrónica puede resolver las conexiones neuronales con un detalle exquisito -teóricamente hasta 0,12 nanómetros, una longitud ligeramente inferior a la de un enlace químico carbono-carbono-, pero el proceso es lento y laborioso. En un estudio, se tardó unos tres años en seccionar y obtener imágenes de un solo cerebro de mosca con un microscopio electrónico de barrido.


El nuevo método se basa en métodos de expansión tisular para lograr una resolución similar, pero a la velocidad de la microscopía óptica. En primer lugar, el equipo etiqueta proteínas específicas en un trozo de cerebro, como las que se encuentran en los sitios presinápticos o en las uniones gap, que median las señales eléctricas entre las células. A continuación, hincha el tejido hasta ocho veces su volumen normal y toma una serie de imágenes 2D mediante microscopía de red de láminas de luz, que ilumina todo un plano de tejido a la vez.


Por último, unen las imágenes en un vídeo 3D. Una herramienta informática de aprendizaje automático disponible gratuitamente puede localizar y cuantificar automáticamente el número y el tamaño de las conexiones neuronales y exportar estos datos a una tabla para su posterior análisis. El protocolo completo dura aproximadamente una semana y es adecuado para su uso con ratones, moscas de la fruta, nematodos y otros organismos, afirma el investigador del estudio Joshua Lillvis, científico investigador del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn (Virginia).


"Podemos cuantificar las sinapsis a nivel estructural y ver si cambian en función de la experiencia o la disfunción neuronal en las distintas especies", explica Lillvis. "Hay muchas posibilidades, y estamos ansiosos por ver qué hace la gente con esto".


Otro equipo fue el primero en combinar la expansión de tejidos y la microscopía de lámina de luz para obtener imágenes de cerebros de Drosophila y ratón, en 2019. Pero esa herramienta sufrió dos problemas: la validación -sus resultados nunca se compararon con una técnica estándar de oro como la microscopía electrónica- y la sobrecarga de datos. Las imágenes de microscopía de alta resolución pueden llenar fácilmente más de 10 terabytes de un disco duro.


El nuevo estudio, publicado en eLife en octubre, aborda ambos problemas. Para confirmar que la microscopía de lámina luminosa y la expansión tisular producen resultados similares a los de la microscopía electrónica, Lillvis y sus colegas extrajeron el lóbulo óptico de moscas de la fruta y utilizaron un anticuerpo para etiquetar una proteína de andamiaje llamada Bruchpilot en sitios presinápticos. Las imágenes de microscopía electrónica indicaron que cada neurona tenía, de media, 207 sitios presinápticos, cifra comparable a la registrada con el método de la lámina luminosa.


Resolver el problema del tamaño de los archivos exigió una táctica diferente. El equipo de Lillvis modificó una herramienta de software gratuita llamada VVD Viewer para que admitiera archivos de imagen de gran tamaño y los uniera en un espacio 3D. También desarrollaron una red neuronal convolucional, entrenada con imágenes de diferentes sinapsis, para detectar automáticamente sinapsis y segmentar neuronas individuales en las imágenes.


"La principal aportación está en el proceso computacional y el análisis", afirma Limor Freifeld, profesora adjunta de Ingeniería Biomédica del Technion - Instituto Tecnológico de Israel en Haifa, que no participó en el trabajo. "Además, el hecho de que tomen estos grandes conjuntos de datos y, de forma automática, segmenten de forma fiable las neuronas y las sinapsis y cuantifiquen los datos es significativo".


El nuevo método puede utilizarse para estudiar cómo los factores genéticos o ambientales alteran las conexiones neuronales en organismos individuales, afirma Lillvis.


Como prueba de concepto, Lillvis etiquetó dos tipos de neuronas del cerebro de la mosca, llamadas pC2l y pIP10, que intervienen en el cortejo masculino. Cada mosca canta utilizando diferentes sonidos -impulsos y zumbidos- para cortejar a una hembra, un comportamiento que se desencadena al activarse las neuronas pC2l. Las neuronas pIP10 son necesarias y suficientes para que las moscas emitan sonidos pulsátiles, y también se cree que determinan qué canción específica canta cada mosca. Los científicos sabían que estos dos tipos de neuronas estaban físicamente conectadas, pero no hasta qué punto interactuaban.


Para averiguarlo, Lillvis y sus colegas emparejaron a siete machos con siete hembras durante 10 minutos. Después extrajeron el cerebro de cada mosca, utilizaron optogenética -una técnica para "encender" neuronas mediante pulsos de luz- para activar las neuronas pC2l y registraron simultáneamente las señales de calcio, un indicador indirecto de la actividad neuronal, en las neuronas pIP10.


La expansión tisular y la microscopía de lámina de luz revelaron que las neuronas pC2l y pIP10 del cerebro de cada mosca tenían 92 conexiones de media. Al correlacionar el número de sitios sinápticos de cada neurona con las señales de calcio, Lillvis y sus colegas hallaron una relación directa, en la que "más conexiones estructurales conducían a más conexiones funcionales", afirma.


Estos experimentos son un primer paso hacia la resolución de las conexiones entre el conectoma físico del cerebro y los comportamientos individuales, afirma Lillvis.


Cite este artículo: https://doi.org/10.53053/COSI6228





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