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Las nuevas herramientas de edición genética eliminan largos tramos de ADN


Restauración de la función: A diferencia del sistema CRISPR convencional (izquierda), un nuevo método (derecha) puede eliminar un tramo de ADN y reemplazar una porción faltante de un gen, restaurando la expresión del gen en el hígado de los ratones (flechas).



POR CHLOE WILLIAMS

Fuente: Spectrum | 17/11/2021

Fotografía: Autism Spectrum



Dos nuevos métodos permiten eliminar largas secciones del genoma, ampliando las capacidades del editor de genes CRISPR.


Dos nuevos métodos permiten eliminar largas secciones del genoma, ampliando las capacidades del editor de genes CRISPR. Estas técnicas podrían conducir a terapias que eliminen grandes inserciones o duplicaciones relacionadas con el autismo, como las repeticiones de ADN que subyacen al síndrome X frágil.


Para eliminar un segmento de ADN, los sistemas CRISPR suelen utilizar una enzima llamada Cas9 para cortar el ADN de doble cadena en dos puntos. La propia maquinaria de reparación de la célula puede entonces unir los extremos cortados, omitiendo la secuencia intermedia. Pero este proceso es propenso a errores y puede insertar o eliminar segmentos de ADN no deseados, llamados "indels", o reorganizar grandes secciones del genoma. El recorte de ADN de doble cadena también puede causar la muerte de las células.


Un sistema diferente basado en CRISPR, denominado "edición primaria", puede hacer que la reparación del ADN sea más precisa. En una de las versiones de la técnica, un complejo de proteínas llamado editor primario corta sólo una hebra de ADN en uno de los dos sitios y la hebra opuesta en el otro sitio. El editor primario añade una secuencia a una de las cadenas cortadas para guiar la reparación.


Al igual que los sistemas CRISPR convencionales, el editor primario utiliza una cadena de ARN para guiar la maquinaria de edición hacia una secuencia objetivo. Pero ese segmento de ARN -llamado pegARN- también proporciona una plantilla para la extensión de ADN, que normalmente se une a una secuencia complementaria en la hebra opuesta. Con eliminaciones más largas, la extensión de ADN puede estar demasiado lejos de su objetivo para guiar la reparación, por lo que los investigadores sólo han podido eliminar secuencias de menos de 100 bases, o "letras", de longitud.


Las dos nuevas técnicas permiten a los investigadores eliminar hasta 10.000 letras de ADN. Ambas fueron descritas en octubre en Nature Biotechnology.

Primado por pares:


En el primer método, los investigadores utilizaron un par de pegARN para guiar la maquinaria de edición para cortar sitios objetivo en cadenas de ADN opuestas y extender cada cadena con una secuencia específica. Pensaron que una segunda extensión de ADN podría ayudar a guiar a la primera a su lugar de unión en el genoma. El equipo programó las extensiones para que fueran complementarias al ADN a ambos lados de la secuencia que querían eliminar. Cuando las hebras correspondientes se unían, la secuencia entre ellas se borraba.


Para probar el sistema, los investigadores crearon pares de pegARN diseñados para borrar varias secuencias -de entre 24 y 10.204 letras de longitud- y los entregaron, junto con un editor principal, a un lote de células humanas cultivadas. A modo de comparación, también utilizaron una enzima Cas9 convencional para realizar las mismas eliminaciones en otro lote de células.


El nuevo método, denominado PRIME-Del, funcionó con la misma eficacia que el sistema CRISPR convencional e introdujo muchos menos errores, informaron los investigadores. Cuando borraron una secuencia de 10.204 letras utilizando PRIME-Del, sólo el 3 por ciento de las secuencias cercanas al sitio editado contenían indels, en comparación con más de la mitad de las secuencias editadas mediante Cas9.


Los investigadores también pudieron insertar segmentos de ADN en la unión de la deleción. En una de las pruebas, diseñaron cinco pares de pegRNAs programados para eliminar una porción de un gen en un bucle de ADN llamado plásmido. Cada par también codificaba una secuencia, de entre 3 y 30 letras, que se añadía al plásmido en el lugar editado.


El equipo informó de que el borrado y la inserción simultáneos de secuencias provocaron errores mínimos y fueron tan eficaces como el borrado de ADN por sí solo. Con este método, los investigadores podrían introducir etiquetas moleculares en el genoma o evitar cambiar inadvertidamente la forma en que un gen se traduce en proteína cuando se borra el ADN.


PRIME-Del también podría causar menos daño a las células que los sistemas CRISPR convencionales porque no provoca roturas de ADN de doble cadena. Los científicos podrían combinar este método con ensayos que introduzcan diversas mutaciones en las células para investigar sus efectos, dicen los investigadores. El equipo planea explorar cómo las regiones reguladoras del genoma contribuyen al autismo de esta manera.

Cortar y pegar:


Otro equipo de investigadores desarrolló una forma diferente de eliminar e insertar secuencias de ADN. Su método, denominado PEDAR, sustituye una secuencia del genoma por otra.


Al igual que con el primer enfoque, los investigadores utilizaron un par de pegRNAs para escoltar la maquinaria de edición a dos sitios que flanquean un segmento de ADN que querían eliminar. Sin embargo, un editor primario modificado cortó ambas cadenas de ADN en lugar de una. A continuación, el editor añadió ADN monocatenario complementario que codificaba una nueva secuencia en las cadenas opuestas, lo que guió la reparación y sustituyó la secuencia flanqueada.


El equipo diseñó un par de pegARN para eliminar una porción de 991 letras de un gen y sustituirla por una secuencia de 18 letras. A continuación, combinaron los pegRNAs con el editor primario modificado, un editor primario convencional o una enzima Cas9 y evaluaron el rendimiento de cada sistema.


Sólo el editor primario modificado borró e insertó las secuencias objetivo, aunque el complejo proteico generó ediciones no deseadas a un ritmo comparable al de Cas9. Otras pruebas revelaron que el PEDAR también puede editar secuencias más largas, insertando segmentos de hasta 60 letras de longitud y borrando secuencias de aproximadamente 10.000 letras.


En otro experimento, el equipo utilizó PEDAR para editar un gen en un modelo de ratón de tirosinemia, una enfermedad causada por mutaciones en un gen que codifica una enzima y que puede provocar un fallo hepático. En el modelo de ratón, una secuencia de más de 1.000 letras sustituye lo que debería ser un segmento de 19 letras del gen y altera su función.


Utilizando PEDAR para eliminar la inserción larga y sustituir el segmento que faltaba, los investigadores restauraron la función del gen. Los investigadores informaron de que la tinción con anticuerpos del tejido hepático de los ratones una semana después del tratamiento reveló que las células expresaban la enzima desaparecida.


Según los investigadores, el nuevo método podría utilizarse para desarrollar terapias génicas para diversas enfermedades. Están trabajando para optimizar la eficacia y precisión del sistema.


Cite este artículo: https://doi.org/10.53053/DJPR5209


https://www.spectrumnews.org/news/toolbox/new-gene-editing-tools-delete-long-stretches-of-dna/?utm_source=Spectrum+Newsletters&utm_campaign=b11015c71a-EMAIL_CAMPAIGN_2021_11_16_09_30&utm_medium=email&utm_term=0_529db1161f-b11015c71a-169086874



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