La inhibición de MEK mejora los fenotipos de comportamiento social en un modelo de ratón




POR SARAH C. BORRIE, ELLEN PLASSCHAERT, ZSUZSANNA CALLAERTS-VEGH, AKIHIKO YOSHIMURA, RUDI D'HOOGE, YPE ELGERSMA, STEVEN A. KUSHNER, ERIC LEGIUS Y HILDE BREMS

Fuente: Molecular Autism | 26/07/2021

Fotografía: Pixabay



La inhibición de MEK mejora los fenotipos de comportamiento social en un modelo de ratón knockout de Spred1 para trastornos de RASopathy


Molecular Autism volumen 12, número de artículo: 53 (2021)



Resumen


Antecedentes


Las RASopatías son un grupo de trastornos que resultan de mutaciones en genes que codifican proteínas implicadas en la regulación de la vía de señalización Ras-MAPK, y tienen una mayor incidencia de trastorno del espectro autista (TEA). El síndrome de Legius es una rara RASopatía causada por mutaciones de pérdida de función en el gen SPRED1. El fenotipo del paciente es similar, pero más leve, al de la Neurofibromatosis tipo 1, otra SRA causada por mutaciones de pérdida de función en el gen NF1. Las RASopatías exhiben una mayor activación de la señalización Ras-MAPK y se manifiestan comúnmente con deficiencias cognitivas y TEA. Aquí, investigamos si un modelo de ratón Spred1-/- para el síndrome de Legius recapitula los síntomas similares a los del TEA, y si dirigirse a la vía Ras-MAPK tiene potencial terapéutico en este modelo de ratón de RASopatía.



Métodos


Investigamos los comportamientos sociales y comunicativos en los ratones Spred1-/- y sondeamos los mecanismos terapéuticos que subyacen a los fenotipos conductuales observados mediante la focalización farmacológica de la vía Ras-MAPK con el inhibidor de MEK PD325901.



Resultados


Los ratones Spred1-/- presentan un fuerte aumento de la dominancia social en la prueba del tubo automatizado y una reducción de las vocalizaciones ultrasónicas en la edad adulta durante la comunicación social. La vocalización ultrasónica neonatal también estaba alterada, con diferencias significativas en las propiedades espectrales. Los ratones Spred1-/- también muestran un comportamiento de anidación deteriorado. El tratamiento agudo con un inhibidor de MEK en la edad adulta con PD325901 revirtió el aumento de la dominancia social en los ratones Spred1-/ a niveles normales, y mejoró el comportamiento de anidación en los ratones Spred1-/ adultos.



Limitaciones


Este estudio utilizó un protocolo de tratamiento agudo para administrar el fármaco. No se sabe cuáles serían los efectos del tratamiento a largo plazo sobre el comportamiento. Se necesitan más estudios para determinar la dosis más baja de este fármaco que se requiere para alterar el comportamiento social de los Spred1-/-. Por último, nuestros hallazgos son en un modelo de ratón homocigoto, mientras que los pacientes llevan mutaciones heterocigotas. Estos factores deben tenerse en cuenta antes de sacar cualquier conclusión traslacional.



Conclusiones


Estos resultados demuestran por primera vez que los fenotipos de comportamiento social en un modelo de ratón para las RASopatías (Spred1-/-) pueden ser revertidos de forma aguda. Esto pone de relieve un papel clave para la desregulación de Ras-MAPK en la mediación de los fenotipos de comportamiento social en modelos de ratón para el TEA, lo que sugiere que la regulación adecuada de la señalización de Ras-MAPK es importante para el comportamiento social.



Antecedentes


El Trastorno del Espectro Autista (TEA) es un trastorno del neurodesarrollo genéticamente heterogéneo. El TEA sindrómico, en el que los síndromes genéticos raros tienen una mayor penetrancia para el TEA, representa aproximadamente el 5% de la incidencia global del TEA [1]. El diagnóstico de TEA requiere dos criterios clínicos: (1) déficits en la interacción social y la comunicación social, y (2) patrones de comportamiento restringidos y repetitivos, que pueden incluir hiper o hipoactividad a la entrada sensorial [2]. Los trastornos de las RASopatías provienen de mutaciones en los genes que codifican los reguladores de la señalización de la proteína quinasa activada por Ras (Ras-MAPK), y los pacientes presentan una mayor incidencia de TEA [3,4,5,6,7,8]. Las RASopatías también dan lugar a fenotipos superpuestos en los ámbitos cardíaco, craneofacial y dermatológico, así como a un mayor riesgo tumoral [9]. La RASopatía Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es una forma sindrómica importante de TEA, resultante de mutaciones en el gen NF1 que codifica para la neurofibromina, un regulador negativo de Ras. Los problemas sociales entre los niños y adultos con NF1 están bien documentados [10,11,12], y se estima que el 10-25% de los pacientes tienen TEA [5, 13, 14]. La incidencia de TEA en el síndrome de Noonan, otra rasopatía (afección causada por mutaciones en ciertos genes), es de alrededor del 30% [3]. Es probable que la desregulación de la señalización Ras-MAPK también sea importante para los TEA no sindrómicos, ya que se ha demostrado que es un importante centro de la red de señalización en el que convergen los genes relacionados con los TEA [15].


El síndrome de Legius es una rara RASopatía resultante de mutaciones en SPRED1 (Sprouty Related EVH1 Domain Containing 1) [16], un miembro de la familia de proteínas Spred y regulador negativo de Ras. El síndrome de Legius se presenta como una forma más leve de NF1, con ~ 50% de pacientes que cumplen los criterios clínicos de NF1 [17]. Una revisión de los fenotipos clínicos de los pacientes con síndrome de Legius publicados hasta la fecha se presenta en el archivo adicional 1: Tabla 1. Se mantiene una base de datos de mutaciones en SPRED1 en https://databases.lovd.nl/shared/genes/SPRED1 y hasta la fecha se ha informado de 287 individuos (de todas las edades). Al igual que los pacientes con NF1, los pacientes con síndrome de Legius tienen manchas de café con leche, pecas axilares o inguinales y macrocefalia, pero no tienen otras manifestaciones de NF1 como neurofibromas, gliomas de la vía óptica o tumores malignos de la vaina del nervio periférico. Al igual que ocurre con la NF1, en la mayoría de los estudios sobre el síndrome de Legius se han notificado fenotipos cognitivos, incluidos problemas de aprendizaje y/o discapacidades intelectuales [16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]. También se observan con frecuencia retrasos en el desarrollo, TDAH e hiperactividad [16,17,18, 20, 21, 27, 28] y se han notificado rasgos autistas o trastorno del espectro autista en un subconjunto de pacientes [20, 27, 28]. Sin embargo, debido al reducido número de pacientes, no ha sido posible investigar la prevalencia y las características específicas del TEA en el síndrome de Legius con escalas de valoración estándar, como se ha hecho en el caso de la NF1 y otras SRAA como el síndrome de Noonan [3, 5, 6, 13, 14, 29]. Un estudio que investigó la inteligencia y el comportamiento con cuestionarios estándar en 15 pacientes con síndrome de Legius pudo demostrar que el coeficiente intelectual de rendimiento es menor en estos pacientes, pero no tuvo la potencia suficiente para detectar si había diferencias significativas en las subpuntuaciones de comportamiento en comparación con una cohorte de NF1 [28].



Tabla 1. Cohortes, número de animales y condiciones de alojamiento para todos los experimentos de comportamiento


(Véase en inglés, en el siguiente enlace)


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00458-2/tables/1



Además del solapamiento clínico entre la NF1 y el síndrome de Legius, a nivel bioquímico la proteína SPRED1 interactúa con la neurofibromina, reclutando la neurofibromina a la membrana y permitiendo la actividad Ras-GAP de la neurofibromina y la supresión de la activación de ERK aguas abajo [23, 30]. Las mutaciones patogénicas con sentido erróneo en el dominio EVH1 (de unión a la neurofibromina) de SPRED1 provocan una disminución de la afinidad por la neurofibromina y la atenuación de la supresión de ERK [23]. El solapamiento bioquímico y clínico entre la NF1 y el síndrome de Legius sugiere que los modelos de ratón Spred1 pueden ofrecer información sobre los mecanismos moleculares compartidos que subyacen a ambos síndromes. Reforzando aún más esta hipótesis, un reciente estudio clínico comparó el fenotipo del TEA en tres RASopatías, la NF1, el síndrome de Noonan y el síndrome cardiofaciocutáneo (CFC), cada uno de los cuales proviene de mutaciones en diferentes reguladores de la vía RAS-MAPK. Esto reveló que el perfil del TEA era relativamente similar en todas las RASopatías [4]. Hubo diferencias significativas en el retraso y la trayectoria del desarrollo entre las RASopatías, pero las puntuaciones del Programa de Observación del Diagnóstico del Autismo (ADOS) no fueron significativamente diferentes, lo que sugiere que puede ser posible una cierta generalización de la etiología mecánica en las RASopatías.


Los modelos de ratón para las SRAs presentan sistemáticamente déficits cognitivos, modelando algunos aspectos de los fenotipos cognitivos de los pacientes [31]. Los ratones Nf1+/- y Spred1-/- tienen una memoria espacial dependiente del hipocampo en el laberinto de agua de Morris [32,33,34] y los ratones Nf1+/- tienen una disfunción de la memoria de trabajo [35]. Los ratones Spred1-/- también tienen un menor rendimiento en el aprendizaje de la discriminación visual [32] y un deterioro del aprendizaje operante instrumental [36]. En consonancia con estas alteraciones en los comportamientos dependientes del hipocampo, se observan defectos en la LTP del hipocampo tanto en los ratones Nf1+/- como en los Spred1-/- [32, 34]. Los ratones Nf1+/- presentan deficiencias en la memoria de reconocimiento social a largo plazo, pero su preferencia a corto plazo por la novedad social está intacta [37, 38]. Sin embargo, no se sabe si los ratones Spred1-/- también pueden modelar alteraciones sociales y de comportamiento relevantes para el TEA.


Aquí, examinamos los comportamientos relacionados con el TEA en un modelo de ratón Spred1-/- para el síndrome de Legius. Los ratones Spred1-/- mostraron un comportamiento social anormal en la prueba del tubo automatizado y un comportamiento de construcción de nidos deteriorado. La comunicación por vocalización ultrasónica estaba alterada en Spred1-/-, tanto en el desarrollo neonatal temprano como en la edad adulta en respuesta a estímulos sociales. La inhibición farmacológica aguda de la vía Ras-MAPK con un inhibidor de MEK en la edad adulta revirtió el comportamiento anormal de dominancia social y las deficiencias en la construcción de nidos en Spred1-/-, lo que apunta a un papel clave de la desregulación de la señalización Ras-MAPK en la regulación del comportamiento social.



Métodos


Animales


Los ratones Spred1-/- se generaron como se describió previamente [39]. Los ratones Spred1+/- fueron retrocruzados al menos 10 veces en el fondo C57BL/6 J (B6) antes de la cría para generar animales experimentales. En dos cohortes separadas de ratones para la prueba del tubo automatizado y el campo abierto (véase la Tabla 1), los ratones Spred1+/- de fondo B6 se cruzaron con ratones 129T2/SvEmJ, y los híbridos F2 (denominados B6;129T2 de aquí en adelante) de estos cruces se utilizaron para los experimentos. Los ratones fueron genotipados por PCR del ADN extraído de la biopsia neonatal del dedo del pie. Para todos los experimentos de comportamiento en los que se analizaron ratones Spred1-/-, se utilizaron como control ratones Spred1 + / + de tipo salvaje (en adelante, WT), que eran compañeros de camada de la cría Spred1+/- x Spred1+/-. Los ratones se alojaron en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas y todas las pruebas de comportamiento se llevaron a cabo en el ciclo de luz. La cama era de Lignocel® BK 8/15, y la comida y el agua de laboratorio estándar estaban disponibles ad libitum. Los detalles sobre las cohortes de ratones para todas las pruebas de comportamiento se resumen en la Tabla 1, con información sobre la cepa de fondo, el sexo, la edad, el alojamiento y cualquier tratamiento farmacológico. Todos los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal de la KU Leuven o el Comité de Ética Animal del Erasmus MC Rotterdam de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea 2010/63/UE.



Prueba de tubo automatizada


Los ratones fueron destetados a las 3-4 semanas y alojados en parejas del mismo sexo, con un ratón WT y otro Spred1-/- juntos (Tabla 1). Ocasionalmente, al destetar, no se disponía inmediatamente de una pareja del genotipo/sexo correcto. En ese caso, el ratón se alojaba en grupo con compañeros de camada del mismo sexo hasta que se destetaba la siguiente camada, y entonces se emparejaba adecuadamente. Si se realizaba esta reordenación del alojamiento, se hacía a más tardar a las 6 semanas de edad. Las pruebas se llevaron a cabo en ratones adultos en cohortes emparejadas por edad, a partir de los 2-3 meses de edad. Los ratones eran ingenuos desde el punto de vista conductual antes de los experimentos de ensayo con tubos y no se utilizaron para otros experimentos de comportamiento, para no interferir con la jerarquía social. El aparato automatizado de ensayo en tubo (Benedictus Systems, Rotterdam, Países Bajos) ha sido descrito previamente [40, 41]. En resumen, se trata de un tubo de fibra de vidrio transparente de 50 cm de largo con una puerta central, conectado en ambos extremos a cajas de fibra de vidrio con puertas de entrada automatizadas, y un sistema de seguimiento por infrarrojos. Los protocolos de entrenamiento y de torneo se llevaron a cabo basándose en estudios anteriores [40]. Primero se realizó un protocolo de entrenamiento de 5 días para todos los ratones. El día 1 los ratones recibieron 2 ensayos de habituación con las puertas abiertas, permitiendo la libre exploración del tubo durante un máximo de 180 s, o hasta que los ratones atravesaron el tubo hasta la otra caja. En los días 2-5, los ratones tenían un límite de 30 s para atravesar el tubo, tras lo cual eran asistidos manualmente. Si los ratones permanecían en la caja inicial durante más de 5 s, recibían una bocanada de aire para ayudarles a entrar en el tubo. Recibieron 6 ensayos en total cada día, partiendo de cajas alternas. Dos días después de terminar el entrenamiento, se inició el protocolo de torneo, que duró 5 días. En cada día de torneo, los ratones recibían 2 ensayos de entrenamiento, 45 minutos antes de que comenzaran los partidos del torneo. En los partidos, se colocaba un ratón en cada caja, y las puertas se abrían automáticamente de forma simultánea, permitiendo a los ratones entrar en el tubo. Si el ratón permanecía en la caja durante más de 5 s, recibía una bocanada de aire. La puerta central se abría automáticamente cuando ambos ratones estaban a menos de 4 cm de la puerta. El partido se completaba cuando uno de los ratones se retiraba con las 4 patas a su caja inicial (se le asignaba el "perdedor"), y al otro se le asignaba el "ganador". El aparato se limpiaba con una solución de etanol al 70% después de cada ensayo de entrenamiento y de cada torneo. En todos los torneos se enfrentaron cohortes de 4-6 jaulas de parejas del mismo sexo (n = 4-6 ratones/genotipo). Tanto las cohortes de machos como las de hembras se probaron en fondos híbridos B6 y B6;129T2 F2. Para las cohortes en el fondo B6;129T2, se jugaron partidos entre todos los ratones y se analizan y presentan los partidos WT-Spred1-/-. Para todas las demás cohortes, incluyendo los estudios con inhibidores de MEK, los partidos se jugaron sólo entre ratones WT y Spred1-/- en cada cohorte. Para los estudios de inhibidores de MEK, se utilizaron cohortes de ratones machos y hembras. En cada día de torneo, se jugaron los mismos partidos, pero con un orden pseudo-aleatorio, alternando la caja de salida y equilibrando el intervalo entre partidos. Los experimentos se repitieron en cohortes independientes para verificar la reproducibilidad.



Vocalización ultrasónica neonatal inducida por la separación materna


Para las crías, el día de nacimiento se definió como día postnatal 0 (P0). Se evaluaron las llamadas ultrasónicas emitidas por las crías en las etapas neonatales de P4, P6, P8, P10 y P12. Estos ratones fueron una cohorte separada que no se utilizó para los ensayos de comportamiento de los adultos. Cada día de la prueba, las crías fueron retiradas individualmente del nido y colocadas en un recipiente de plástico vacío situado dentro de una caja de espuma de poliestireno que atenuaba el sonido. Se colocó un micrófono de ultrasonidos, sensible a frecuencias de 10-180 kHz (micrófono de ultrasonidos de condensador Avisoft UltrasoundGate CM16, Avisoft Bioacoustics e.K., Glienicke/Nordbahn, Alemania), a través de un orificio en la caja de espuma de poliestireno a unos 20 cm por encima de la cría. Las vocalizaciones ultrasónicas (USV) se grabaron durante 3 minutos con el software Avisoft-RECORDER, utilizando una tasa de muestreo de 250 kHz y un formato de 16 bits. Tras las pruebas, se pesaron las crías y se devolvieron al nido. Después de las pruebas en P4, las crías también se identificaron individualmente con un tatuaje en la pata utilizando una aguja de jeringa 22G llena de tinta china. Se analizaron dos cohortes independientes. En la segunda cohorte, también se evaluó el reflejo de enderezamiento en los ratones en P4 y P8, tras el registro de la VUE. Se colocó a las crías de espaldas y se registró el tiempo que tardaban en enderezarse sobre las cuatro patas. Se agruparon los datos de ambos sexos, ya que no se observaron diferencias significativas en la vocalización entre sexos (datos no mostrados). También excluimos la experiencia de la madre como un factor importante que influyera en nuestros datos (datos no mostrados), y presentamos aquí los datos agrupados de los cachorros nacidos de madres ingenuas y experimentadas.



Vocalización ultrasónica de los adultos a los estímulos sociales


Se midieron las VU durante el comportamiento de cortejo en una cohorte separada de ratones machos adultos, de 10-11 semanas de edad, en respuesta a hembras adultas desconocidas. Los ratones adultos sujetos al estudio fueron alojados durante la noche con una hembra adulta B6 para que tuvieran experiencia sexual. A continuación, se alojaron individualmente durante 3 días. Los ratones B6 hembra adultos (de 2 a 3 meses de edad) que sirvieron de estímulo eran diferentes a los ratones utilizados para el alojamiento nocturno, y fueron alojados en grupo [4-5 ratones por jaula]. A los ratones hembra no se les indujo el celo, y no se hizo un seguimiento del ciclo estral. El día de la prueba, el sujeto macho fue colocado en una jaula de prueba limpia, en una caja de espuma de poliestireno con atenuación de sonido y con un micrófono de ultrasonido encima, como se describió anteriormente. Los ratones se habituaron durante 10 minutos al nuevo entorno. En los últimos 4 minutos, se realizó un registro de referencia. A continuación, se introdujo en la jaula un ratón hembra desconocido y se dejó que los ratones interactuaran libremente mientras se registraban los USV durante 4 min. No se determinó si las USV grabadas eran de ratones machos o hembras, porque en el contexto de un encuentro entre macho y hembra, que probablemente representa las USV de cortejo, las USV son producidas principalmente por los machos [42, 43].



Análisis de las USV


Las propiedades acústicas de los archivos de audio se analizaron con el software Avisoft SASLab Pro (versión 5.2.10, Avisoft Bioacoustics e.K., Glienicke/Nordbahn, Alemania). Los espectrogramas se generaron con una transformación de Fourier (FFT) de 1024 de longitud y una superposición de la ventana de tiempo del 75% (marco del 100%, ventana de Hamming). Se aplicó un filtro de paso alto con un corte de 30 kHz para reducir el ruido de fondo fuera de la banda de frecuencia pertinente. La detección de llamadas se realizó mediante un algoritmo automático basado en el umbral y un mecanismo de tiempo de espera (tiempo de espera 20 ms). Un usuario experimentado, que no conocía el genotipo, comprobó la exactitud de la detección de llamadas para garantizar la concordancia entre la detección automatizada y la observacional. Los parámetros extraídos automáticamente para cada archivo incluían el número de llamadas, la duración media de las llamadas, la frecuencia pico media (tono, kHz) y la amplitud pico media (sonoridad, medida en decibelios) [44]. Para el análisis de las etapas neonatales, no se observaron diferencias de sexo (datos no mostrados), por lo que los datos de las crías macho y hembra se agruparon para el análisis.



Prueba de sociabilidad en tres cámaras y preferencia por la novedad social


Las hembras de ratones WT y Spred1-/- fueron sometidas a pruebas a las 20 semanas de edad (Tabla 1). El aparato era una caja rectangular cerrada de plexiglás transparente con suelo opaco (anchura x profundidad x altura: 94 × 26 × 30 cm), dividida en tres cámaras. La cámara central (42 × 26 cm) estaba conectada a las cámaras izquierda y derecha (26 × 26 cm) a través de aberturas (6 × 8 cm) que podían cerrarse manualmente. Las cámaras izquierda y derecha contenían vasos cilíndricos de alambre (altura x diámetro: 11 × 10 cm). El acceso a las cámaras estaba controlado por puertas de guillotina accionadas manualmente. La prueba consistió en tres fases, realizadas consecutivamente en un aparato de prueba de tres cámaras, como se ha descrito previamente [45]. En la fase de habituación [5 min], los ratones se colocaron en la cámara central para aclimatarse. En la fase de sociabilidad (10 min), se probó el interés del animal por un estímulo social (un congénere del mismo sexo, no utilizado para las pruebas de comportamiento) frente a una cámara vacía, con el ratón del estímulo social constreñido bajo una jaula de alambre en una cámara, y una jaula de alambre vacía en la otra cámara. En la etapa final, la preferencia por la novedad social (10 minutos), se evaluó el interés por un estímulo social familiar frente a un estímulo social no familiar. El aparato se limpiaba entre sujetos con etanol al 70%. Los ratones fueron grabados desde arriba con una cámara y sus cabezas fueron rastreadas utilizando el software ANY-Maze (Stoelting Europe, Irlanda). Se cuantificó el tiempo de olfateo (= tiempo de permanencia a 2 cm de la jaula de alambre) y la longitud del recorrido. Para la fase de sociabilidad, se calculó un índice de preferencia social como sigue Timestranger1/(Timestranger1 + Timeempty).



Intruso residente


Los ratones intrusos (machos adultos B6) fueron alojados individualmente durante 9 días, y su edad se correspondía con la de los residentes. Los intrusos se utilizaron sólo una vez. Cada ratón residente macho (Spred1-/- y WT) fue alojado durante 1 semana antes de la prueba con un ratón hembra B6 adulto, sin cambiar el lecho. El día de la prueba, se introdujo el ratón intruso en la jaula del residente y de la hembra y se calificó el comportamiento durante 30 minutos antes de retirar al intruso. Se midió la latencia hasta que se produjo un ataque, la latencia entre ataques y el número total de ataques.



Campo abierto


El campo abierto se realizó en ratones machos y hembras en el fondo B6;129T2. El campo abierto se realizó en una arena circular de 110 cm de diámetro. Los ratones se colocaron suavemente en el centro de la arena y se les permitió explorar libremente durante 10 minutos. La arena se limpió con etanol al 70% entre sujetos. Los ratones fueron grabados desde arriba con una cámara y su posición corporal fue seguida con el sistema de seguimiento por vídeo SMART (Panlab, Barcelona, España). Para el análisis, la arena se dividió en tres regiones: región interior de 25 cm de diámetro, rodeada por una región intermedia de 10 cm de radio y luego una región exterior de 10 cm de radio. Se calculó la longitud total del recorrido y el porcentaje de tiempo empleado en cada región. No se observaron diferencias de sexo, por lo que se agruparon los datos de ambos sexos para el análisis.



Comportamiento de anidación


La construcción de nidos se llevó a cabo siguiendo un protocolo previamente descrito [46]. Una semana antes de la prueba, los ratones fueron alojados individualmente en jaulas de plástico Makrolon 3108 estándar, con material de cama limpio de 5 cm de profundidad pero sin elementos de enriquecimiento ambiental para habituarse. La fase de prueba fue un protocolo de 2 días. El día 1 los ratones recibieron nidos de algodón prensado con un peso total de 3 g al mediodía. El comportamiento de construcción de nidos se evaluó el día 2, por la mañana. Para la evaluación cualitativa, se utilizó una escala de valoración de 5 puntos, tal como se había publicado anteriormente [46], con una puntuación de "1" que representaba materiales de nidificación sin tocar (sin triturar) y "5" que indicaba un nido perfecto con lados altos.



Enterramiento de mármol


Los ratones fueron habituados durante 10 minutos en una gran jaula de plástico Makrolon 3108 (375 × 215 × 140 mm) con material de cama limpio de 5 cm de profundidad (Lignocel® BK 8/15). Posteriormente, se probó el enterramiento en mármol durante 40 min. Durante la fase de prueba, las jaulas contenían material de cama limpio de 5 cm de profundidad con 10 canicas de vidrio (14 mm de diámetro) dispuestas en una cuadrícula de 2 × 5 sobre la cama. Se utilizaron 10 canicas en lugar de 20 para reducir el impacto de la sobreexposición a estímulos simultáneos. Se contó el número de canicas enterradas. Se consideró que una canica estaba enterrada cuando 2/3 de la canica estaba cubierta por el lecho.



Madriguera


La madriguera es un comportamiento innato, descrito en este experimento como "cavar un agujero o un túnel en o a través de las bolitas de comida en un tubo". El experimento se llevó a cabo basándose en un protocolo previamente descrito [47]. En la fase de habituación, el día 1, se coloca un tubo de madriguera lleno durante la noche en la jaula de origen del grupo de ratones, que más tarde son examinados individualmente. Cada madriguera se rellena con 200 g de pellets de comida que normalmente se suministran como dieta. La fase de pruebas comenzó el día 2 alrededor de las 5 de la tarde, ya que los ratones están normalmente despiertos a esta hora y la madriguera comienza más lentamente que durante la fase de oscuridad, cuando los ratones son muy activos. Los ratones se colocaron individualmente en jaulas de plástico Makrolon 3108 junto con un tubo de madriguera lleno. Dos horas después del inicio, se tomó una medida instantánea del peso de los gránulos de comida restantes; se vació la madriguera en un recipiente y se pesó, luego se volvieron a colocar los gránulos en la madriguera y se volvieron a colocar en la jaula. Si el ratón estaba en la madriguera, se extraía con cuidado y se colocaba en la jaula. El peso de los pellets no enterrados se presentó como un porcentaje del peso total de los pellets de comida de 200 g. La segunda lectura se realizó a la mañana siguiente, a las 9 horas, pesando de nuevo los gránulos de comida restantes no enterrados.



Tratamiento con inhibidores de la MEK


El inhibidor de MEK PD325901 (Selleckchem, Múnich, Alemania) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 5 mg/ml y se congeló en alícuotas, que se descongelaron según fuera necesario inmediatamente antes de la inyección. En todos los estudios, los animales del grupo tratado recibieron 5 mg/kg de PD325901, mientras que el grupo del vehículo recibió sólo DMSO. Esta dosis se eligió en base a su eficacia en la atenuación de la fosforilación de ERK en ratones [48, 49] y en la reversión de otros fenotipos en modelos de ratones con RASopatía [50, 51]. Los volúmenes de inyección fueron de 1 µl por g (peso del ratón). Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal en lados alternos cada día con jeringas de insulina de 0,3 ml (BD Micro-Fine). Para los experimentos de pruebas de tubo automatizadas, se inyectaron fármacos diariamente, empezando 3 días antes del primer día de entrenamiento y continuando durante el entrenamiento y los torneos, y las inyecciones se realizaron 5-6 h antes de que se iniciaran las pruebas de comportamiento cada día. Este régimen se basó en estudios anteriores que revirtieron con éxito los fenotipos conductuales en ratones con RASopatía [52, 53]. Para cada experimento de prueba de tubo diferente (WT + DMSO vs Spred1-/- + DMSO; Spred1-/- + DMSO vs Spred1-/- + PD325901; WT + DMSO vs Spred1-/- + PD325901 y WT + DMSO vs WT + PD325901), se utilizó una nueva cohorte separada de ratones que eran ingenuos a la prueba de tubo automatizada. Los ratones se alojaron siempre en parejas, con un ratón de cada "tratamiento" por jaula, como se indica en la Tabla 1. Para los experimentos de construcción de nidos, los ratones fueron inyectados durante 3 días y el protocolo de anidación se inició 5-6 h después de la última inyección, como se ha descrito anteriormente. Después de la prueba inicial de anidación, se dejó a los ratones sin tratar durante 3 semanas para el lavado de la droga, y luego se volvió a probar la construcción de nidos. El entrenamiento/prueba de anidación de cada día se inició 5-6 h después de la inyección.



Western blotting


Para las cohortes de ratones utilizadas para el estudio de inhibición de MEK en la prueba de tubo automatizada, se recogieron lisados del hipocampo para el análisis de Western blot. 1 h después del último torneo de la prueba de tubo automatizado, el día 5, se practicó la eutanasia a los ratones mediante dislocación cervical, se les extrajo el cerebro y se diseccionaron rápidamente los hipocampos y se congelaron en nitrógeno líquido. El tejido se homogeneizó en tampón RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% Na-deoxycholate) con inhibidores de la proteasa (Complete, Roche) e inhibidores de la fosfatasa (PhosphoSTOP, Roche). La concentración de proteínas se ajustó a 1 µg/µL y se cargaron 10 µg de proteínas en un mini-gel NuPAGE Bis-Tris 4-12% (Invitrogen). El blot se sondeó con anticuerpos primarios para pERK (fosfo-p44/42 MAPK #4370, anti-conejo, Cell Signaling Technology) y ERK (p44/42 MAPK #9107, anti-ratón, Cell Signaling Technology). Los anticuerpos secundarios fueron Dylight IR 680 e IR 800 (Thermo Scientific) y se visualizaron utilizando un Amersham Typhoon Biomolecular Imager. El blot se despojó con Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) y se volvió a despojar con beta-actina (A5316, anti-ratón, Sigma-Aldrich) como control de carga. El análisis cuantitativo de imágenes se realizó en ImageJ (v1.51n, NIH) utilizando la función Gels. Se calculó la relación entre la pERK y la ERK total, normalizada con respecto a una muestra del grupo WT-Vehicle del grupo tratado sólo con DMSO (archivo adicional 1: Fig. 4A suplementaria), y se expresó como unidades arbitrarias (u.a.).



Estadísticas


Para los experimentos automatizados de prueba de tubos, incluidos los experimentos con inhibidores de MEK, cada día de la prueba de tubos se analizó con una distribución binomial de dos colas, con la hipótesis nula de que si ambos grupos eran similares, el 50% de los partidos son ganados por cada grupo (es decir, el nivel de azar de la victoria). Para la mayoría de los demás datos, incluyendo el USV de los machos, el enterramiento de las canicas, la madriguera y el western blotting, se comprobó la normalidad de los datos con la prueba de D'Agostino-Pearson. Si los datos tenían una distribución normal, se utilizó una prueba t paramétrica de muestras independientes no apareadas. Si los datos no estaban distribuidos normalmente, se realizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Las USV neonatales se analizaron con un ANOVA de 2 vías con medidas repetidas, con la edad y el genotipo como factores principales. Construcción de nidos: para