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La inhibición de MEK mejora los fenotipos de comportamiento social en un modelo de ratón




POR SARAH C. BORRIE, ELLEN PLASSCHAERT, ZSUZSANNA CALLAERTS-VEGH, AKIHIKO YOSHIMURA, RUDI D'HOOGE, YPE ELGERSMA, STEVEN A. KUSHNER, ERIC LEGIUS Y HILDE BREMS

Fuente: Molecular Autism | 26/07/2021

Fotografía: Pixabay



La inhibición de MEK mejora los fenotipos de comportamiento social en un modelo de ratón knockout de Spred1 para trastornos de RASopathy


Molecular Autism volumen 12, número de artículo: 53 (2021)



Resumen


Antecedentes


Las RASopatías son un grupo de trastornos que resultan de mutaciones en genes que codifican proteínas implicadas en la regulación de la vía de señalización Ras-MAPK, y tienen una mayor incidencia de trastorno del espectro autista (TEA). El síndrome de Legius es una rara RASopatía causada por mutaciones de pérdida de función en el gen SPRED1. El fenotipo del paciente es similar, pero más leve, al de la Neurofibromatosis tipo 1, otra SRA causada por mutaciones de pérdida de función en el gen NF1. Las RASopatías exhiben una mayor activación de la señalización Ras-MAPK y se manifiestan comúnmente con deficiencias cognitivas y TEA. Aquí, investigamos si un modelo de ratón Spred1-/- para el síndrome de Legius recapitula los síntomas similares a los del TEA, y si dirigirse a la vía Ras-MAPK tiene potencial terapéutico en este modelo de ratón de RASopatía.



Métodos


Investigamos los comportamientos sociales y comunicativos en los ratones Spred1-/- y sondeamos los mecanismos terapéuticos que subyacen a los fenotipos conductuales observados mediante la focalización farmacológica de la vía Ras-MAPK con el inhibidor de MEK PD325901.



Resultados


Los ratones Spred1-/- presentan un fuerte aumento de la dominancia social en la prueba del tubo automatizado y una reducción de las vocalizaciones ultrasónicas en la edad adulta durante la comunicación social. La vocalización ultrasónica neonatal también estaba alterada, con diferencias significativas en las propiedades espectrales. Los ratones Spred1-/- también muestran un comportamiento de anidación deteriorado. El tratamiento agudo con un inhibidor de MEK en la edad adulta con PD325901 revirtió el aumento de la dominancia social en los ratones Spred1-/ a niveles normales, y mejoró el comportamiento de anidación en los ratones Spred1-/ adultos.



Limitaciones


Este estudio utilizó un protocolo de tratamiento agudo para administrar el fármaco. No se sabe cuáles serían los efectos del tratamiento a largo plazo sobre el comportamiento. Se necesitan más estudios para determinar la dosis más baja de este fármaco que se requiere para alterar el comportamiento social de los Spred1-/-. Por último, nuestros hallazgos son en un modelo de ratón homocigoto, mientras que los pacientes llevan mutaciones heterocigotas. Estos factores deben tenerse en cuenta antes de sacar cualquier conclusión traslacional.



Conclusiones


Estos resultados demuestran por primera vez que los fenotipos de comportamiento social en un modelo de ratón para las RASopatías (Spred1-/-) pueden ser revertidos de forma aguda. Esto pone de relieve un papel clave para la desregulación de Ras-MAPK en la mediación de los fenotipos de comportamiento social en modelos de ratón para el TEA, lo que sugiere que la regulación adecuada de la señalización de Ras-MAPK es importante para el comportamiento social.



Antecedentes


El Trastorno del Espectro Autista (TEA) es un trastorno del neurodesarrollo genéticamente heterogéneo. El TEA sindrómico, en el que los síndromes genéticos raros tienen una mayor penetrancia para el TEA, representa aproximadamente el 5% de la incidencia global del TEA [1]. El diagnóstico de TEA requiere dos criterios clínicos: (1) déficits en la interacción social y la comunicación social, y (2) patrones de comportamiento restringidos y repetitivos, que pueden incluir hiper o hipoactividad a la entrada sensorial [2]. Los trastornos de las RASopatías provienen de mutaciones en los genes que codifican los reguladores de la señalización de la proteína quinasa activada por Ras (Ras-MAPK), y los pacientes presentan una mayor incidencia de TEA [3,4,5,6,7,8]. Las RASopatías también dan lugar a fenotipos superpuestos en los ámbitos cardíaco, craneofacial y dermatológico, así como a un mayor riesgo tumoral [9]. La RASopatía Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es una forma sindrómica importante de TEA, resultante de mutaciones en el gen NF1 que codifica para la neurofibromina, un regulador negativo de Ras. Los problemas sociales entre los niños y adultos con NF1 están bien documentados [10,11,12], y se estima que el 10-25% de los pacientes tienen TEA [5, 13, 14]. La incidencia de TEA en el síndrome de Noonan, otra rasopatía (afección causada por mutaciones en ciertos genes), es de alrededor del 30% [3]. Es probable que la desregulación de la señalización Ras-MAPK también sea importante para los TEA no sindrómicos, ya que se ha demostrado que es un importante centro de la red de señalización en el que convergen los genes relacionados con los TEA [15].


El síndrome de Legius es una rara RASopatía resultante de mutaciones en SPRED1 (Sprouty Related EVH1 Domain Containing 1) [16], un miembro de la familia de proteínas Spred y regulador negativo de Ras. El síndrome de Legius se presenta como una forma más leve de NF1, con ~ 50% de pacientes que cumplen los criterios clínicos de NF1 [17]. Una revisión de los fenotipos clínicos de los pacientes con síndrome de Legius publicados hasta la fecha se presenta en el archivo adicional 1: Tabla 1. Se mantiene una base de datos de mutaciones en SPRED1 en https://databases.lovd.nl/shared/genes/SPRED1 y hasta la fecha se ha informado de 287 individuos (de todas las edades). Al igual que los pacientes con NF1, los pacientes con síndrome de Legius tienen manchas de café con leche, pecas axilares o inguinales y macrocefalia, pero no tienen otras manifestaciones de NF1 como neurofibromas, gliomas de la vía óptica o tumores malignos de la vaina del nervio periférico. Al igual que ocurre con la NF1, en la mayoría de los estudios sobre el síndrome de Legius se han notificado fenotipos cognitivos, incluidos problemas de aprendizaje y/o discapacidades intelectuales [16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]. También se observan con frecuencia retrasos en el desarrollo, TDAH e hiperactividad [16,17,18, 20, 21, 27, 28] y se han notificado rasgos autistas o trastorno del espectro autista en un subconjunto de pacientes [20, 27, 28]. Sin embargo, debido al reducido número de pacientes, no ha sido posible investigar la prevalencia y las características específicas del TEA en el síndrome de Legius con escalas de valoración estándar, como se ha hecho en el caso de la NF1 y otras SRAA como el síndrome de Noonan [3, 5, 6, 13, 14, 29]. Un estudio que investigó la inteligencia y el comportamiento con cuestionarios estándar en 15 pacientes con síndrome de Legius pudo demostrar que el coeficiente intelectual de rendimiento es menor en estos pacientes, pero no tuvo la potencia suficiente para detectar si había diferencias significativas en las subpuntuaciones de comportamiento en comparación con una cohorte de NF1 [28].



Tabla 1. Cohortes, número de animales y condiciones de alojamiento para todos los experimentos de comportamiento


(Véase en inglés, en el siguiente enlace)


https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-021-00458-2/tables/1



Además del solapamiento clínico entre la NF1 y el síndrome de Legius, a nivel bioquímico la proteína SPRED1 interactúa con la neurofibromina, reclutando la neurofibromina a la membrana y permitiendo la actividad Ras-GAP de la neurofibromina y la supresión de la activación de ERK aguas abajo [23, 30]. Las mutaciones patogénicas con sentido erróneo en el dominio EVH1 (de unión a la neurofibromina) de SPRED1 provocan una disminución de la afinidad por la neurofibromina y la atenuación de la supresión de ERK [23]. El solapamiento bioquímico y clínico entre la NF1 y el síndrome de Legius sugiere que los modelos de ratón Spred1 pueden ofrecer información sobre los mecanismos moleculares compartidos que subyacen a ambos síndromes. Reforzando aún más esta hipótesis, un reciente estudio clínico comparó el fenotipo del TEA en tres RASopatías, la NF1, el síndrome de Noonan y el síndrome cardiofaciocutáneo (CFC), cada uno de los cuales proviene de mutaciones en diferentes reguladores de la vía RAS-MAPK. Esto reveló que el perfil del TEA era relativamente similar en todas las RASopatías [4]. Hubo diferencias significativas en el retraso y la trayectoria del desarrollo entre las RASopatías, pero las puntuaciones del Programa de Observación del Diagnóstico del Autismo (ADOS) no fueron significativamente diferentes, lo que sugiere que puede ser posible una cierta generalización de la etiología mecánica en las RASopatías.


Los modelos de ratón para las SRAs presentan sistemáticamente déficits cognitivos, modelando algunos aspectos de los fenotipos cognitivos de los pacientes [31]. Los ratones Nf1+/- y Spred1-/- tienen una memoria espacial dependiente del hipocampo en el laberinto de agua de Morris [32,33,34] y los ratones Nf1+/- tienen una disfunción de la memoria de trabajo [35]. Los ratones Spred1-/- también tienen un menor rendimiento en el aprendizaje de la discriminación visual [32] y un deterioro del aprendizaje operante instrumental [36]. En consonancia con estas alteraciones en los comportamientos dependientes del hipocampo, se observan defectos en la LTP del hipocampo tanto en los ratones Nf1+/- como en los Spred1-/- [32, 34]. Los ratones Nf1+/- presentan deficiencias en la memoria de reconocimiento social a largo plazo, pero su preferencia a corto plazo por la novedad social está intacta [37, 38]. Sin embargo, no se sabe si los ratones Spred1-/- también pueden modelar alteraciones sociales y de comportamiento relevantes para el TEA.


Aquí, examinamos los comportamientos relacionados con el TEA en un modelo de ratón Spred1-/- para el síndrome de Legius. Los ratones Spred1-/- mostraron un comportamiento social anormal en la prueba del tubo automatizado y un comportamiento de construcción de nidos deteriorado. La comunicación por vocalización ultrasónica estaba alterada en Spred1-/-, tanto en el desarrollo neonatal temprano como en la edad adulta en respuesta a estímulos sociales. La inhibición farmacológica aguda de la vía Ras-MAPK con un inhibidor de MEK en la edad adulta revirtió el comportamiento anormal de dominancia social y las deficiencias en la construcción de nidos en Spred1-/-, lo que apunta a un papel clave de la desregulación de la señalización Ras-MAPK en la regulación del comportamiento social.



Métodos


Animales


Los ratones Spred1-/- se generaron como se describió previamente [39]. Los ratones Spred1+/- fueron retrocruzados al menos 10 veces en el fondo C57BL/6 J (B6) antes de la cría para generar animales experimentales. En dos cohortes separadas de ratones para la prueba del tubo automatizado y el campo abierto (véase la Tabla 1), los ratones Spred1+/- de fondo B6 se cruzaron con ratones 129T2/SvEmJ, y los híbridos F2 (denominados B6;129T2 de aquí en adelante) de estos cruces se utilizaron para los experimentos. Los ratones fueron genotipados por PCR del ADN extraído de la biopsia neonatal del dedo del pie. Para todos los experimentos de comportamiento en los que se analizaron ratones Spred1-/-, se utilizaron como control ratones Spred1 + / + de tipo salvaje (en adelante, WT), que eran compañeros de camada de la cría Spred1+/- x Spred1+/-. Los ratones se alojaron en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas y todas las pruebas de comportamiento se llevaron a cabo en el ciclo de luz. La cama era de Lignocel® BK 8/15, y la comida y el agua de laboratorio estándar estaban disponibles ad libitum. Los detalles sobre las cohortes de ratones para todas las pruebas de comportamiento se resumen en la Tabla 1, con información sobre la cepa de fondo, el sexo, la edad, el alojamiento y cualquier tratamiento farmacológico. Todos los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal de la KU Leuven o el Comité de Ética Animal del Erasmus MC Rotterdam de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea 2010/63/UE.



Prueba de tubo automatizada


Los ratones fueron destetados a las 3-4 semanas y alojados en parejas del mismo sexo, con un ratón WT y otro Spred1-/- juntos (Tabla 1). Ocasionalmente, al destetar, no se disponía inmediatamente de una pareja del genotipo/sexo correcto. En ese caso, el ratón se alojaba en grupo con compañeros de camada del mismo sexo hasta que se destetaba la siguiente camada, y entonces se emparejaba adecuadamente. Si se realizaba esta reordenación del alojamiento, se hacía a más tardar a las 6 semanas de edad. Las pruebas se llevaron a cabo en ratones adultos en cohortes emparejadas por edad, a partir de los 2-3 meses de edad. Los ratones eran ingenuos desde el punto de vista conductual antes de los experimentos de ensayo con tubos y no se utilizaron para otros experimentos de comportamiento, para no interferir con la jerarquía social. El aparato automatizado de ensayo en tubo (Benedictus Systems, Rotterdam, Países Bajos) ha sido descrito previamente [40, 41]. En resumen, se trata de un tubo de fibra de vidrio transparente de 50 cm de largo con una puerta central, conectado en ambos extremos a cajas de fibra de vidrio con puertas de entrada automatizadas, y un sistema de seguimiento por infrarrojos. Los protocolos de entrenamiento y de torneo se llevaron a cabo basándose en estudios anteriores [40]. Primero se realizó un protocolo de entrenamiento de 5 días para todos los ratones. El día 1 los ratones recibieron 2 ensayos de habituación con las puertas abiertas, permitiendo la libre exploración del tubo durante un máximo de 180 s, o hasta que los ratones atravesaron el tubo hasta la otra caja. En los días 2-5, los ratones tenían un límite de 30 s para atravesar el tubo, tras lo cual eran asistidos manualmente. Si los ratones permanecían en la caja inicial durante más de 5 s, recibían una bocanada de aire para ayudarles a entrar en el tubo. Recibieron 6 ensayos en total cada día, partiendo de cajas alternas. Dos días después de terminar el entrenamiento, se inició el protocolo de torneo, que duró 5 días. En cada día de torneo, los ratones recibían 2 ensayos de entrenamiento, 45 minutos antes de que comenzaran los partidos del torneo. En los partidos, se colocaba un ratón en cada caja, y las puertas se abrían automáticamente de forma simultánea, permitiendo a los ratones entrar en el tubo. Si el ratón permanecía en la caja durante más de 5 s, recibía una bocanada de aire. La puerta central se abría automáticamente cuando ambos ratones estaban a menos de 4 cm de la puerta. El partido se completaba cuando uno de los ratones se retiraba con las 4 patas a su caja inicial (se le asignaba el "perdedor"), y al otro se le asignaba el "ganador". El aparato se limpiaba con una solución de etanol al 70% después de cada ensayo de entrenamiento y de cada torneo. En todos los torneos se enfrentaron cohortes de 4-6 jaulas de parejas del mismo sexo (n = 4-6 ratones/genotipo). Tanto las cohortes de machos como las de hembras se probaron en fondos híbridos B6 y B6;129T2 F2. Para las cohortes en el fondo B6;129T2, se jugaron partidos entre todos los ratones y se analizan y presentan los partidos WT-Spred1-/-. Para todas las demás cohortes, incluyendo los estudios con inhibidores de MEK, los partidos se jugaron sólo entre ratones WT y Spred1-/- en cada cohorte. Para los estudios de inhibidores de MEK, se utilizaron cohortes de ratones machos y hembras. En cada día de torneo, se jugaron los mismos partidos, pero con un orden pseudo-aleatorio, alternando la caja de salida y equilibrando el intervalo entre partidos. Los experimentos se repitieron en cohortes independientes para verificar la reproducibilidad.



Vocalización ultrasónica neonatal inducida por la separación materna


Para las crías, el día de nacimiento se definió como día postnatal 0 (P0). Se evaluaron las llamadas ultrasónicas emitidas por las crías en las etapas neonatales de P4, P6, P8, P10 y P12. Estos ratones fueron una cohorte separada que no se utilizó para los ensayos de comportamiento de los adultos. Cada día de la prueba, las crías fueron retiradas individualmente del nido y colocadas en un recipiente de plástico vacío situado dentro de una caja de espuma de poliestireno que atenuaba el sonido. Se colocó un micrófono de ultrasonidos, sensible a frecuencias de 10-180 kHz (micrófono de ultrasonidos de condensador Avisoft UltrasoundGate CM16, Avisoft Bioacoustics e.K., Glienicke/Nordbahn, Alemania), a través de un orificio en la caja de espuma de poliestireno a unos 20 cm por encima de la cría. Las vocalizaciones ultrasónicas (USV) se grabaron durante 3 minutos con el software Avisoft-RECORDER, utilizando una tasa de muestreo de 250 kHz y un formato de 16 bits. Tras las pruebas, se pesaron las crías y se devolvieron al nido. Después de las pruebas en P4, las crías también se identificaron individualmente con un tatuaje en la pata utilizando una aguja de jeringa 22G llena de tinta china. Se analizaron dos cohortes independientes. En la segunda cohorte, también se evaluó el reflejo de enderezamiento en los ratones en P4 y P8, tras el registro de la VUE. Se colocó a las crías de espaldas y se registró el tiempo que tardaban en enderezarse sobre las cuatro patas. Se agruparon los datos de ambos sexos, ya que no se observaron diferencias significativas en la vocalización entre sexos (datos no mostrados). También excluimos la experiencia de la madre como un factor importante que influyera en nuestros datos (datos no mostrados), y presentamos aquí los datos agrupados de los cachorros nacidos de madres ingenuas y experimentadas.



Vocalización ultrasónica de los adultos a los estímulos sociales


Se midieron las VU durante el comportamiento de cortejo en una cohorte separada de ratones machos adultos, de 10-11 semanas de edad, en respuesta a hembras adultas desconocidas. Los ratones adultos sujetos al estudio fueron alojados durante la noche con una hembra adulta B6 para que tuvieran experiencia sexual. A continuación, se alojaron individualmente durante 3 días. Los ratones B6 hembra adultos (de 2 a 3 meses de edad) que sirvieron de estímulo eran diferentes a los ratones utilizados para el alojamiento nocturno, y fueron alojados en grupo [4-5 ratones por jaula]. A los ratones hembra no se les indujo el celo, y no se hizo un seguimiento del ciclo estral. El día de la prueba, el sujeto macho fue colocado en una jaula de prueba limpia, en una caja de espuma de poliestireno con atenuación de sonido y con un micrófono de ultrasonido encima, como se describió anteriormente. Los ratones se habituaron durante 10 minutos al nuevo entorno. En los últimos 4 minutos, se realizó un registro de referencia. A continuación, se introdujo en la jaula un ratón hembra desconocido y se dejó que los ratones interactuaran libremente mientras se registraban los USV durante 4 min. No se determinó si las USV grabadas eran de ratones machos o hembras, porque en el contexto de un encuentro entre macho y hembra, que probablemente representa las USV de cortejo, las USV son producidas principalmente por los machos [42, 43].



Análisis de las USV


Las propiedades acústicas de los archivos de audio se analizaron con el software Avisoft SASLab Pro (versión 5.2.10, Avisoft Bioacoustics e.K., Glienicke/Nordbahn, Alemania). Los espectrogramas se generaron con una transformación de Fourier (FFT) de 1024 de longitud y una superposición de la ventana de tiempo del 75% (marco del 100%, ventana de Hamming). Se aplicó un filtro de paso alto con un corte de 30 kHz para reducir el ruido de fondo fuera de la banda de frecuencia pertinente. La detección de llamadas se realizó mediante un algoritmo automático basado en el umbral y un mecanismo de tiempo de espera (tiempo de espera 20 ms). Un usuario experimentado, que no conocía el genotipo, comprobó la exactitud de la detección de llamadas para garantizar la concordancia entre la detección automatizada y la observacional. Los parámetros extraídos automáticamente para cada archivo incluían el número de llamadas, la duración media de las llamadas, la frecuencia pico media (tono, kHz) y la amplitud pico media (sonoridad, medida en decibelios) [44]. Para el análisis de las etapas neonatales, no se observaron diferencias de sexo (datos no mostrados), por lo que los datos de las crías macho y hembra se agruparon para el análisis.



Prueba de sociabilidad en tres cámaras y preferencia por la novedad social


Las hembras de ratones WT y Spred1-/- fueron sometidas a pruebas a las 20 semanas de edad (Tabla 1). El aparato era una caja rectangular cerrada de plexiglás transparente con suelo opaco (anchura x profundidad x altura: 94 × 26 × 30 cm), dividida en tres cámaras. La cámara central (42 × 26 cm) estaba conectada a las cámaras izquierda y derecha (26 × 26 cm) a través de aberturas (6 × 8 cm) que podían cerrarse manualmente. Las cámaras izquierda y derecha contenían vasos cilíndricos de alambre (altura x diámetro: 11 × 10 cm). El acceso a las cámaras estaba controlado por puertas de guillotina accionadas manualmente. La prueba consistió en tres fases, realizadas consecutivamente en un aparato de prueba de tres cámaras, como se ha descrito previamente [45]. En la fase de habituación [5 min], los ratones se colocaron en la cámara central para aclimatarse. En la fase de sociabilidad (10 min), se probó el interés del animal por un estímulo social (un congénere del mismo sexo, no utilizado para las pruebas de comportamiento) frente a una cámara vacía, con el ratón del estímulo social constreñido bajo una jaula de alambre en una cámara, y una jaula de alambre vacía en la otra cámara. En la etapa final, la preferencia por la novedad social (10 minutos), se evaluó el interés por un estímulo social familiar frente a un estímulo social no familiar. El aparato se limpiaba entre sujetos con etanol al 70%. Los ratones fueron grabados desde arriba con una cámara y sus cabezas fueron rastreadas utilizando el software ANY-Maze (Stoelting Europe, Irlanda). Se cuantificó el tiempo de olfateo (= tiempo de permanencia a 2 cm de la jaula de alambre) y la longitud del recorrido. Para la fase de sociabilidad, se calculó un índice de preferencia social como sigue Timestranger1/(Timestranger1 + Timeempty).



Intruso residente


Los ratones intrusos (machos adultos B6) fueron alojados individualmente durante 9 días, y su edad se correspondía con la de los residentes. Los intrusos se utilizaron sólo una vez. Cada ratón residente macho (Spred1-/- y WT) fue alojado durante 1 semana antes de la prueba con un ratón hembra B6 adulto, sin cambiar el lecho. El día de la prueba, se introdujo el ratón intruso en la jaula del residente y de la hembra y se calificó el comportamiento durante 30 minutos antes de retirar al intruso. Se midió la latencia hasta que se produjo un ataque, la latencia entre ataques y el número total de ataques.



Campo abierto


El campo abierto se realizó en ratones machos y hembras en el fondo B6;129T2. El campo abierto se realizó en una arena circular de 110 cm de diámetro. Los ratones se colocaron suavemente en el centro de la arena y se les permitió explorar libremente durante 10 minutos. La arena se limpió con etanol al 70% entre sujetos. Los ratones fueron grabados desde arriba con una cámara y su posición corporal fue seguida con el sistema de seguimiento por vídeo SMART (Panlab, Barcelona, España). Para el análisis, la arena se dividió en tres regiones: región interior de 25 cm de diámetro, rodeada por una región intermedia de 10 cm de radio y luego una región exterior de 10 cm de radio. Se calculó la longitud total del recorrido y el porcentaje de tiempo empleado en cada región. No se observaron diferencias de sexo, por lo que se agruparon los datos de ambos sexos para el análisis.



Comportamiento de anidación


La construcción de nidos se llevó a cabo siguiendo un protocolo previamente descrito [46]. Una semana antes de la prueba, los ratones fueron alojados individualmente en jaulas de plástico Makrolon 3108 estándar, con material de cama limpio de 5 cm de profundidad pero sin elementos de enriquecimiento ambiental para habituarse. La fase de prueba fue un protocolo de 2 días. El día 1 los ratones recibieron nidos de algodón prensado con un peso total de 3 g al mediodía. El comportamiento de construcción de nidos se evaluó el día 2, por la mañana. Para la evaluación cualitativa, se utilizó una escala de valoración de 5 puntos, tal como se había publicado anteriormente [46], con una puntuación de "1" que representaba materiales de nidificación sin tocar (sin triturar) y "5" que indicaba un nido perfecto con lados altos.



Enterramiento de mármol


Los ratones fueron habituados durante 10 minutos en una gran jaula de plástico Makrolon 3108 (375 × 215 × 140 mm) con material de cama limpio de 5 cm de profundidad (Lignocel® BK 8/15). Posteriormente, se probó el enterramiento en mármol durante 40 min. Durante la fase de prueba, las jaulas contenían material de cama limpio de 5 cm de profundidad con 10 canicas de vidrio (14 mm de diámetro) dispuestas en una cuadrícula de 2 × 5 sobre la cama. Se utilizaron 10 canicas en lugar de 20 para reducir el impacto de la sobreexposición a estímulos simultáneos. Se contó el número de canicas enterradas. Se consideró que una canica estaba enterrada cuando 2/3 de la canica estaba cubierta por el lecho.



Madriguera


La madriguera es un comportamiento innato, descrito en este experimento como "cavar un agujero o un túnel en o a través de las bolitas de comida en un tubo". El experimento se llevó a cabo basándose en un protocolo previamente descrito [47]. En la fase de habituación, el día 1, se coloca un tubo de madriguera lleno durante la noche en la jaula de origen del grupo de ratones, que más tarde son examinados individualmente. Cada madriguera se rellena con 200 g de pellets de comida que normalmente se suministran como dieta. La fase de pruebas comenzó el día 2 alrededor de las 5 de la tarde, ya que los ratones están normalmente despiertos a esta hora y la madriguera comienza más lentamente que durante la fase de oscuridad, cuando los ratones son muy activos. Los ratones se colocaron individualmente en jaulas de plástico Makrolon 3108 junto con un tubo de madriguera lleno. Dos horas después del inicio, se tomó una medida instantánea del peso de los gránulos de comida restantes; se vació la madriguera en un recipiente y se pesó, luego se volvieron a colocar los gránulos en la madriguera y se volvieron a colocar en la jaula. Si el ratón estaba en la madriguera, se extraía con cuidado y se colocaba en la jaula. El peso de los pellets no enterrados se presentó como un porcentaje del peso total de los pellets de comida de 200 g. La segunda lectura se realizó a la mañana siguiente, a las 9 horas, pesando de nuevo los gránulos de comida restantes no enterrados.



Tratamiento con inhibidores de la MEK


El inhibidor de MEK PD325901 (Selleckchem, Múnich, Alemania) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 5 mg/ml y se congeló en alícuotas, que se descongelaron según fuera necesario inmediatamente antes de la inyección. En todos los estudios, los animales del grupo tratado recibieron 5 mg/kg de PD325901, mientras que el grupo del vehículo recibió sólo DMSO. Esta dosis se eligió en base a su eficacia en la atenuación de la fosforilación de ERK en ratones [48, 49] y en la reversión de otros fenotipos en modelos de ratones con RASopatía [50, 51]. Los volúmenes de inyección fueron de 1 µl por g (peso del ratón). Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal en lados alternos cada día con jeringas de insulina de 0,3 ml (BD Micro-Fine). Para los experimentos de pruebas de tubo automatizadas, se inyectaron fármacos diariamente, empezando 3 días antes del primer día de entrenamiento y continuando durante el entrenamiento y los torneos, y las inyecciones se realizaron 5-6 h antes de que se iniciaran las pruebas de comportamiento cada día. Este régimen se basó en estudios anteriores que revirtieron con éxito los fenotipos conductuales en ratones con RASopatía [52, 53]. Para cada experimento de prueba de tubo diferente (WT + DMSO vs Spred1-/- + DMSO; Spred1-/- + DMSO vs Spred1-/- + PD325901; WT + DMSO vs Spred1-/- + PD325901 y WT + DMSO vs WT + PD325901), se utilizó una nueva cohorte separada de ratones que eran ingenuos a la prueba de tubo automatizada. Los ratones se alojaron siempre en parejas, con un ratón de cada "tratamiento" por jaula, como se indica en la Tabla 1. Para los experimentos de construcción de nidos, los ratones fueron inyectados durante 3 días y el protocolo de anidación se inició 5-6 h después de la última inyección, como se ha descrito anteriormente. Después de la prueba inicial de anidación, se dejó a los ratones sin tratar durante 3 semanas para el lavado de la droga, y luego se volvió a probar la construcción de nidos. El entrenamiento/prueba de anidación de cada día se inició 5-6 h después de la inyección.



Western blotting


Para las cohortes de ratones utilizadas para el estudio de inhibición de MEK en la prueba de tubo automatizada, se recogieron lisados del hipocampo para el análisis de Western blot. 1 h después del último torneo de la prueba de tubo automatizado, el día 5, se practicó la eutanasia a los ratones mediante dislocación cervical, se les extrajo el cerebro y se diseccionaron rápidamente los hipocampos y se congelaron en nitrógeno líquido. El tejido se homogeneizó en tampón RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% Na-deoxycholate) con inhibidores de la proteasa (Complete, Roche) e inhibidores de la fosfatasa (PhosphoSTOP, Roche). La concentración de proteínas se ajustó a 1 µg/µL y se cargaron 10 µg de proteínas en un mini-gel NuPAGE Bis-Tris 4-12% (Invitrogen). El blot se sondeó con anticuerpos primarios para pERK (fosfo-p44/42 MAPK #4370, anti-conejo, Cell Signaling Technology) y ERK (p44/42 MAPK #9107, anti-ratón, Cell Signaling Technology). Los anticuerpos secundarios fueron Dylight IR 680 e IR 800 (Thermo Scientific) y se visualizaron utilizando un Amersham Typhoon Biomolecular Imager. El blot se despojó con Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) y se volvió a despojar con beta-actina (A5316, anti-ratón, Sigma-Aldrich) como control de carga. El análisis cuantitativo de imágenes se realizó en ImageJ (v1.51n, NIH) utilizando la función Gels. Se calculó la relación entre la pERK y la ERK total, normalizada con respecto a una muestra del grupo WT-Vehicle del grupo tratado sólo con DMSO (archivo adicional 1: Fig. 4A suplementaria), y se expresó como unidades arbitrarias (u.a.).



Estadísticas


Para los experimentos automatizados de prueba de tubos, incluidos los experimentos con inhibidores de MEK, cada día de la prueba de tubos se analizó con una distribución binomial de dos colas, con la hipótesis nula de que si ambos grupos eran similares, el 50% de los partidos son ganados por cada grupo (es decir, el nivel de azar de la victoria). Para la mayoría de los demás datos, incluyendo el USV de los machos, el enterramiento de las canicas, la madriguera y el western blotting, se comprobó la normalidad de los datos con la prueba de D'Agostino-Pearson. Si los datos tenían una distribución normal, se utilizó una prueba t paramétrica de muestras independientes no apareadas. Si los datos no estaban distribuidos normalmente, se realizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Las USV neonatales se analizaron con un ANOVA de 2 vías con medidas repetidas, con la edad y el genotipo como factores principales. Construcción de nidos: para los ratones ingenuos se utilizó una prueba t independiente no apareada. Para los experimentos con inhibidores de la MEK que evaluaban el anidamiento, se realizó un ANOVA de 2 vías con el tratamiento y el genotipo como factores. Para la sociabilidad y la preferencia social, se analizó el tiempo de olfateo con un ANOVA de 2 vías, utilizando la cámara y el genotipo como factores. El índice de preferencia por la sociabilidad se analizó con una prueba t independiente no apareada. Se utilizó un nivel de significación de 0,05 para todos los análisis estadísticos. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).



Resultados


Los ratones Spred1-/- muestran un comportamiento social y comunicativo alterado


Para examinar si los comportamientos sociales estaban alterados en los ratones Spred1-/-, evaluamos a los ratones en la prueba del tubo automatizado, que mide la dominancia social [40]. Los ratones Spred1-/- en un fondo B6;129T2 ganaron la mayoría de los partidos contra oponentes de tipo salvaje (WT), un fenotipo estable a lo largo de 5 días de torneos (Fig. 1A, B). Este fenotipo de dominancia social se observó tanto en los ratones Spred1-/ como en las hembras (Fig. 1B) frente a los controles WT (prueba binomial de dos colas para los machos en comparación con el azar (50%): día 1 p < 0. 0001; día 2 p < 0,0001; día 3 p = 0,011; día 4 p < 0,0001; hembras-prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 1 p = 0,0011; día 3 p = 0,0011; día 4 p = 0,0251; día 5 p = 0,01). Como la cepa de fondo puede influir en el comportamiento, verificamos que este fenotipo era robusto a la cepa de fondo, observando que el mismo fenotipo de dominancia social se observaba en los ratones Spred1-/- cuando se retrocruzaban más de 10 generaciones en el fondo B6, tanto en los machos (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria. 4A; prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 2 p = 0,0213; día 3 p = 0,0213; día 4 p = 0,0213; día 5 p = 0,0005) como en cohortes de hembras (archivo adicional 1: Fig. 1A suplementaria; prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 2 p = 0,0013; día 3 p < 0,0001; día 4 p < 0,0001; día 5 p < 0,0001). No se observaron diferencias de genotipo en el tiempo para alcanzar la puerta central en la fase de entrenamiento de la prueba del tubo (Archivo adicional 1: Fig. 1B suplementaria, fondo B6; ANOVA de 2 vías: efecto del día F(8,64) = 3,296, p = 0,0033; sin efecto del genotipo, sin interacción), y los pesos corporales se mantuvieron estables a lo largo del experimento (Archivo adicional 1: Fig. 1C suplementaria, fondo B6). El fenotipo de dominancia social no se observó en los ratones macho Spred1+/- cuando jugaron partidos contra los controles WT en la prueba de tubo automatizado (Archivo adicional 1: Fig. 1D-F suplementaria; prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%), días 1-5 p > 0,1). Examinamos si el fenotipo de dominancia social en los ratones Spred1-/- macho estaba vinculado a la agresión realizando la prueba del intruso residente en una cohorte separada de ratones. No hubo diferencias ni en la latencia para atacar ni en el número total de ataques que los ratones machos Spred1/- realizaron a los intrusos en comparación con sus compañeros de camada WT (Archivo adicional 1: Fig. 1G-H suplementaria; prueba t de latencia no apareada, t = 1,794, df = 16, p = 0,0918; prueba t de ataques totales no apareada, t = 1,386, df = 16, p = 0,1848). En una prueba de campo abierto, los ratones Spred1-/- mostraron una trigmotaxis normal, lo que sugiere que no eran menos ansiosos que los controles WT (archivo adicional 1: Fig. suplementaria 3C). El acercamiento social y la preferencia social en la prueba de interacción social de 3 cámaras fueron normales en los ratones Spred1-/ (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 2A-C; índice de preferencia en la fase de sociabilidad-prueba t no apareada, t = 0,6898, df = 25, p = 0,4967. Preferencia social - ANOVA de 2 vías, efecto del lado de la cámara: F(1,25) = 6,396, p = 0,0181; sin efecto del genotipo). Hubo una reducción significativa en el número de transiciones entre compartimentos realizadas por los ratones Spred1-/- en ambas fases de la prueba (Archivo adicional 1: Fig. Suplementaria 2D-E. Fase de sociabilidad-prueba t no apareada, t = 2,805, df = 25, p = 0,0096. Fase de preferencia social-prueba t no apareada, t = 2,061, df = 25, p = 0,0499), sin embargo la actividad locomotora en el campo abierto fue normal (Archivo adicional 1: Fig. Suplementaria 3D). Este fenotipo es similar a la actividad locomotora ligeramente inferior observada en ratones Spred1-/- en cámaras operantes [36].



Figura 1



Deterioros sociales y comunicativos en ratones Spred1-/-. A, B Prueba de tubo automatizada para la dominancia social. A Porcentaje medio de partidos ganados por día en la prueba de tubo automatizada a lo largo de 5 días de torneos entre ratones WT y Spred1-/-, fondo 129T2/SEMvJ. Efecto significativo del genotipo en los días 1-4 (prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 1 p < 0,0001; día 2 p < 0,0001; día 3 p = 0,011; día 4 p < 0. 0001). Gráficos de cajas y bigotes de la mediana y los cuartiles de 2 experimentos independientes, agrupados; n = 8 ratones macho/genotipo. B Porcentaje medio de partidos ganados por día en la prueba del tubo a lo largo de 5 días de torneos entre ratones hembra WT y Spred1-/- en el fondo 129T2/SVEmJ. Efecto significativo del genotipo en los días 1, 3, 4 y 5 (prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 1 p = 0,0011; día 3 p = 0,0011; día 4 p = 0,0251; día 5 p = 0. 01). Gráficos de cajas y bigotes de la mediana y los cuartiles de 2 experimentos independientes, agrupados; n = 8 ratones/genotipo. C-F USVs de ratones macho WT y Spred1-/- (fondo B6) a una nueva hembra B6: C Número de llamadas USV/min realizadas por los ratones macho (prueba t no apareada, t = 4,481, df = 27 p = 0,0001). D Duración media de las llamadas de los ratones macho en respuesta a una nueva hembra (prueba de Mann Whitney, p = 0,0002). E Frecuencia máxima media de las llamadas USV (prueba t no apareada, t = 1,001, df = 27, p = 0,3258). F Amplitud máxima media de las llamadas USV (prueba t no apareada, t = 0,8998, df = 27, p = 0,3762). n = 14-15 ratones/genotipo, media ± SEM. G Puntuación de la construcción del nido de las hembras de ratones Spred1-/- y WT (fondo B6) después de 24 horas, indicando la calidad de la construcción del nido. 1 = sin trituración del nido; 5 = nido de lados altos con todo el material triturado (prueba t no apareada, t = 3,496, df = 34, p = 0,0013). n = 17-19 ratones/genotipo, media ± SEM. En todas las figuras, los asteriscos indican: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001



Figura 2



Los ratones Spred1-/- presentan déficits en la vocalización ultrasónica neonatal. Se registraron las USV neonatales tras la separación materna en ratones WT y Spred1-/- desde P4 hasta P12. A Índice medio de llamadas por minuto (ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto principal de la edad, F(4,156) = 12,28, ****p < 0,0001, sin efecto del genotipo, sin interacción). Media ± SEM. B Duración media de las llamadas en milisegundos (ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto de la edad, F(4,156) = 7,347, p < 0,0001; sin efecto del genotipo; sin interacción). C Frecuencia pico media de las llamadas USV (ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto de la edad F(4,150) = 5,866, p = 0,0002; efecto del genotipo F(1,150) = 55,13, p < 0,0001; sin interacción). D Amplitud pico media de las llamadas USV (ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto de la edad F(4,205) = 10,77, p < 0,0001, efecto del genotipo F(1,205) = 9,181, p = 0,0028; sin interacción). Para todos los análisis, n = 22-24 ratones/genotipo. Los gráficos de violín muestran la mediana y los cuartiles. En C y D, los asteriscos indican las pruebas de comparaciones múltiples post-hoc de Bonferroni: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001



Figura 3



La inhibición de MEK suprime el fenotipo de dominancia social en los ratones Spred1-/-. A Porcentaje medio de partidos ganados por día en la prueba del tubo a lo largo de 5 días de torneos entre WT tratados con vehículo DMSO y ratones Spred1-/- tratados con PD325901. Pruebas binomiales de dos colas comparadas con el azar (50%): no hay diferencias significativas el día 1-5. n = 8 ratones/genotipo. B Porcentaje medio de partidos ganados por día en la prueba del tubo a lo largo de 5 días de torneos entre los ratones Spred1-/- tratados con vehículo DMSO y los ratones Spred1-/- tratados con PD325901, con diferencias significativas en los días 1-3 (prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 1 p = 0,0011; día 2 p = 0,0011; día 3 p = 0,025). n = 6 ratones/genotipo. C Porcentaje medio de partidos ganados por día en la prueba del tubo a lo largo de 5 días de torneos entre WT tratados con vehículo DMSO y ratones WT tratados con PD325901. Pruebas binomiales de dos colas comparadas con el azar (50%): diferencias significativas día 2-5; Pruebas binomiales de dos colas comparadas con el azar (50%): día 2 p = 0,0003; día 3 p = 0,0003; día 4 p < 0,0001; día 5 p < 0,0001. n = 8 ratones/genotipo. Todos los gráficos son de caja y bigotes con mediana y cuartiles. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001



Para estudiar la comunicación social en los ratones Spred1-/- y WT, se midió la vocalización ultrasónica (USV) de los machos durante el encuentro con una nueva hembra B6. Los ratones machos Spred1-/- (fondo B6) emitieron significativamente menos USV en respuesta a una hembra en comparación con los controles de camada WT (Fig. 1C; prueba t no apareada, t = 4,481, df = 27 p = 0,0001). También emitieron en promedio llamadas de menor duración en comparación con los WT (Fig. 1D; prueba de Mann Whitney, p = 0,0002). El tono medio (frecuencia pico media) y la amplitud de las llamadas (amplitud pico media) no se alteraron significativamente (Fig. 1E-F; prueba t de frecuencia no apareada, t = 1,001, df = 27, p = 0,3258; prueba t de amplitud no apareada, t = 0,8998, df = 27, p = 0,3762). Los comportamientos innatos, como la construcción de nidos, contribuyen al bienestar y apoyan las funciones sociales en los ratones [54], por lo que se examinó el comportamiento de construcción de nidos en hembras adultas Spred1-/- y en controles de camada de tipo salvaje. Spred1-/- tenía un comportamiento de anidación reducido, con una puntuación de anidación significativamente menor en comparación con los ratones WT, una indicación de la calidad de la construcción de nidos (Fig. 1G; prueba t no apareada, t = 3,496, df = 34, p = 0,0013). Para investigar los comportamientos repetitivos en esta línea de ratones, se evaluaron los comportamientos que requieren cavar, ya que cavar se ha interpretado como un comportamiento repetitivo. No se observaron diferencias de genotipo en el porcentaje de canicas enterradas entre los ratones WT y Spred1-/- (Archivo adicional 1: Fig. 2F suplementaria. Machos: prueba t no apareada, t = 0,4545, df = 14, p = 0,6564. Hembras: prueba t no apareada, t = 0,8402, df = 20, p = 0,4107). El comportamiento de madriguera se evaluó como una medida con más validez ecológica que el enterramiento en mármol, ya que el comportamiento de madriguera se observa en roedores salvajes [47, 54]. La cantidad de gránulos de comida enterrados después de 2 horas o durante la noche, tampoco se modificó en los ratones Spred1-/- (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 2G. ANOVA de 2 vías con medidas repetidas, F < 1,00; p > 0,1). Por lo tanto, Spred1-/- tienen un comportamiento social y una comunicación deteriorados, pero no presentan fenotipos de excavación que sean representativos de cambios en los comportamientos repetitivos.



Los déficits de comunicación social en los ratones Spred1-/- surgen neonatalmente


A continuación, nos preguntamos si los déficits de VU ya están presentes en el desarrollo neonatal temprano de los ratones Spred1-/-. Se midieron las vocalizaciones ultrasónicas inducidas por el aislamiento en cachorros Spred1-/- y WT (en el fondo B6) desde P4-12. No hubo diferencias significativas entre los sexos en ninguno de los puntos temporales, por lo que los datos de las crías macho y hembra se agruparon para el análisis. Tal y como se ha informado previamente en la literatura para los ratones B6 [55], la tasa de vocalización alcanzó un máximo en P8 en los ratones WT, y luego disminuyó a niveles bajos de nuevo por P12 (Fig. 2A. ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto principal de la edad, F(4,156) = 12,28, p < 0,0001, sin efecto del genotipo). No se observó ningún efecto principal del genotipo sobre la velocidad de llamada (Fig. 2A) o la duración de la llamada (Fig. 2B; ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto de la edad, F(4,156) = 7,347, p < 0,0001; sin efecto del genotipo). El análisis de las propiedades espectrales de las USVs de Spred1-/- y WT reveló un efecto principal del genotipo sobre el tono de la llamada (Fig. 2C; ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto de la edad F(4,150) = 5,866, p = 0,0002; efecto del genotipo F(1,150) = 55,13, p < 0,0001), con comparaciones post-hoc que revelaron disminuciones significativas en la frecuencia media de los picos en las llamadas de las crías de Spred1-/- comparadas con las de WT de P8-P12. También se observó un efecto principal del genotipo sobre el volumen en decibelios de la llamada en Spred1-/- en comparación con WT, con un análisis post-hoc que reveló un aumento significativo de la amplitud en P10 (Fig. 2D; ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto de la edad F(4,205) = 10,77, p < 0,0001, efecto del genotipo F(1,205) = 9,181, p = 0,0028). No se observó ningún efecto principal del genotipo sobre el peso corporal (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 3A; ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto principal de la edad, F(4,159) = 1325, p < 0,0001, sin efecto del genotipo). No se observaron diferencias de genotipo en el reflejo de giro a la derecha en P4 o P8 (Archivo adicional 1: Fig. 3B suplementaria; ANOVA de 2 vías con medidas repetidas: efecto principal de la edad, F(1,29) = 77,15, p < 0,0001; sin efecto del genotipo), lo que indica capacidades motoras intactas en las crías Spred1-/-. En conjunto, estos datos indican una alteración de las propiedades de vocalización espectral en los ratones Spred1-/- neonatales que emerge principalmente en la segunda semana neonatal.



La inhibición farmacológica aguda de la vía Ras-MAPK puede mejorar los fenotipos sociales en los ratones Spred1-/-


La sobreactivación de la señalización Ras-MAPK es un rasgo distintivo de los trastornos por RASopatía. A continuación nos preguntamos si la inhibición de la señalización MAPK descendente podría restaurar los comportamientos sociales en los ratones Spred1-/-. El PD325901 es un potente inhibidor de MEK que ha demostrado reducir los neurofibromas tanto en modelos de ratón Nf1 [50] como en ensayos clínicos en fase inicial en pacientes humanos con NF1 [56]. El PD325901 atraviesa la barrera hematoencefálica, como demuestran los informes de neurotoxicidad en humanos [57], y se ha confirmado aún más en ratones, donde se ha demostrado que la administración periférica de PD325901 suprime la activación de ERK inducida por la cocaína en el estriado [48] y reduce la fosforilación hiperactiva de ERK en el hipocampo en un modelo de ratón con RASopatía HRasG12V [49]. Para comprobar el efecto del PD325901 en el comportamiento social en la edad adulta, se realizaron experimentos de prueba de tubo en ratones Spred1-/- y WT en el fondo B6 tratados agudamente con PD325901 o con el control de vehículo DMSO. Todas las cohortes aprendieron a correr por el tubo en las sesiones de entrenamiento (Archivo adicional 1: Fig. 4B, Archivo adicional 1: Fig. 4E, Archivo adicional 1: Fig. 5 A-C). Cuando los ratones Spred1-/- tratados con PD325901 jugaron partidos contra ratones WT que recibieron vehículo, el fenotipo ganador dominante de los ratones Spred1-/- en la prueba del tubo fue abolido, con una victoria a nivel de azar (Fig. 3A). Confirmando que la PD325901 normaliza el comportamiento de dominancia social de los ratones Spred1-/ en diferentes condiciones sociales, vimos que los ratones Spred1-/ tratados con PD325901 perdían significativamente más partidos contra los Spred1-/- que recibían el vehículo, un efecto que se mantuvo estable a lo largo de los 3 primeros días de torneos (Fig. 3B; prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 1 p = 0,0011; día 2 p = 0,0011; día 3 p = 0,025). Los torneos de la prueba del tubo cuando tanto los ratones Spred1-/- como los WT recibieron el control del vehículo recapitularon el fenotipo de los ratones Spred1-/- ingenuos sobre los ratones WT (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 4A, 4D. Machos: prueba binomial de dos colas comparada con el azar (50%): día 2 p = 0,0213; día 3 p = 0,0213; día 4 p = 0,0213; día 5 p = 0,0005. Hembras-prueba binomial de dos colas en comparación con el azar (50%): día 2 p < 0,0001; día 4 p = 0,005; día 5 p = 0,0042), lo que demuestra que el tratamiento con el vehículo solo no influyó significativamente en el comportamiento. Notablemente, los ratones WT fueron tratados con PD325901, ganaron significativamente más partidos contra los ratones WT tratados con vehículo (Fig. 3C. Pruebas binomiales de dos colas en comparación con el azar (50%): día 2 p = 0,0003; día 3 p = 0,0003; día 4 p < 0,0001; día 5 p < 0,0001). Esto indica una interacción fármaco x genotipo, por lo que en los ratones Spred1-/- el efecto de la PD325901 fue reducir la ganancia, pero en los ratones WT la PD325901 tuvo el efecto contrario, aumentando la ganancia. No se observaron diferencias entre los grupos en cuanto al peso a lo largo del experimento (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 4C, F; Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 5 A-C), y confirmamos que en todas las configuraciones de cohortes, el tratamiento con PD325901 atenuó significativamente la activación de ERK en el hipocampo en comparación con el tratamiento con vehículo, verificando la especificidad del efecto del fármaco (Archivo adicional 1: Fig. suplementaria 6A-D. Cohorte WT + vehículo vs Spred1-/- + vehículo - prueba t no apareada, t = 0,1777, df = 8, p = 0,8634. Prueba t no emparejada de WT + vehículo vs cohorte Spred1-/- + PD325901, t = 19,69, df = 6, p < 0,0001. Prueba t no apareada de Spred1-/- + vehículo frente a cohorte de Spred1-/- + PD325901, t = 3,846, df = 10, p = 0,0032. WT + vehículo vs WT + PD325901-prueba t no apareada, t = 6,957, df = 6, p = 0,0004). De acuerdo con estudios anteriores [32, 36], no observamos diferencias significativas en los niveles totales de pERK del hipocampo en los ratones Spred1-/- en comparación con los WT. La inhibición aguda de MEK también mejoró significativamente el comportamiento de anidación en los ratones Spred1-/, aumentando las puntuaciones de construcción de nidos a niveles similares a los de los ratones WT (Fig. 4A; ANOVA de 2 vías: efecto del tratamiento con PD325901 F(1,26) = 28,81, p < 0,0001; efecto del genotipo F(1,26) = 6,679, p = 0,0157; sin interacción). Después de un lavado de 3 semanas, el efecto de la PD325901 sobre el comportamiento de anidación de Spred1-/- fue abolido en gran medida, demostrando además la causalidad de la inhibición de MEK en el rescate del comportamiento (Fig. 4B; ANOVA de 2 vías: sin efecto del tratamiento, efecto del genotipo F(1,26) = 15,99, p = 0,0005; sin interacción). En conjunto, estos resultados muestran que el tratamiento agudo con PD325901 revierte los fenotipos de comportamiento social en ratones Spred1-/- adultos.



Figura 4



La inhibición de MEK rescata las deficiencias en el comportamiento de anidación en los ratones Spred1-/-. A Los ratones WT y Spred1-/- fueron tratados con PD325901 o con el vehículo DMSO durante 3 días, y luego se evaluó la construcción de nidos mediante una puntuación cualitativa de construcción de nidos. El PD325901 aumentó significativamente la puntuación de construcción de nidos en los ratones Spred1-/- (ANOVA de 2 vías: efecto del tratamiento con PD325901 F(1,26) = 28,81, p < 0,0001; efecto del genotipo F(1,26) = 6,679, p = 0,0157; sin interacción). Las comparaciones post-hoc muestran una diferencia significativa entre los grupos WT + DMSO y Spred1-/- + DMSO (prueba de comparación múltiple de Sidak, **p = 0,0066), mientras que no se observaron diferencias entre los grupos WT + PD325901 y Spred1-/- + PD325901 (prueba de comparación múltiple de Sidak, p = 0,8955). B Tras un periodo de lavado de 3 semanas, se evaluó de nuevo la construcción de nidos (ANOVA de 2 vías: sin efecto del tratamiento, efecto del genotipo F(1,26) = 15,99, p = 0,0005; sin interacción). Media ± SEM, n = 7-8 ratones/genotipo




Discusión


Este estudio demostró que las alteraciones del comportamiento social en un modelo de ratón para los trastornos de la SRA pueden ser rescatadas de forma aguda mediante la inhibición farmacológica de MEK. Un modelo de ratón Spred1-/- para el síndrome de Legius presenta un fenotipo que modela los fenotipos sociales vinculados al TEA, con una mayor dominancia social y déficits en la comunicación USV, así como un comportamiento de anidación deteriorado. Además, pudimos rescatar los fenotipos sociales de Spred1-/- en la edad adulta mediante la inhibición aguda de MEK, el primer informe de un fármaco dirigido a la vía Ras-MAPK que rescata el comportamiento social en un modelo de ratón para el TEA. Estos resultados indican un papel crucial de la señalización Ras-MAPK en la regulación de los comportamientos sociales.


El fenotipo de dominancia social observado en los ratones Spred1-/- se observó en ambos sexos, y también fue robusto a la cepa de fondo. Por lo tanto, postulamos que las alteraciones sociales observadas en los ratones Spred1-/ son un fenotipo robusto adecuado para el descubrimiento de fármacos terapéuticos preclínicos. Aunque los pacientes con el síndrome de Legius son portadores de mutaciones heterocigóticas de pérdida de función en SPRED1 [16], no observamos alteraciones de la dominancia social en los ratones Spred1+/-. Trabajos anteriores han demostrado que los ratones Spred1 + / - presentan un leve deterioro en el aprendizaje de la discriminación visual, con un fenotipo cognitivo menos grave que el de los ratones Spred1-/- [32], lo que sugiere que los fenotipos cognitivos relevantes se modelan más claramente en un modelo de ratón homocigoto. Existe un precedente de esto, ya que aunque muchos trastornos que presentan TEA surgen de mutaciones heterocigotas, con frecuencia sólo se observan fenotipos robustos en ratones homocigotos para la mutación, como se ha observado en modelos de ratón para el gen asociado al autismo SHANK2 [58, 59].


En particular, el fenotipo de aumento de la dominancia social observado en los ratones Spred1-/- es muy similar al aumento de la dominancia social observado en la prueba del tubo en varios otros modelos de ratón para formas monogénicas de TEA, incluyendo varios modelos diferentes de ratón Shank3 [60, 61], ratones Shank2Δ6-7 [62] y ratones Fmr1 y/- [40]. El aumento de la ganancia en el tubo puede modelar una incapacidad para reconocer el estatus social de los congéneres. Aunque observamos un comportamiento de dominancia social anormal en la prueba del tubo a lo largo de múltiples días de prueba, los ratones Spred1-/- no muestran ningún fenotipo en la prueba de tres cámaras para la sociabilidad, ni en las fases de aproximación social ni de preferencia social de la prueba. Esto es consistente con los estudios de otros modelos de ratón para las RASopatías, donde se han observado comportamientos normales de acercamiento social en ratones Raf1L613V, ratones KRasG12V y ratones Nf1+/- [37, 63, 64]. La preferencia social también es normal en los ratones Nf1+/- [37], pero la memoria social a largo plazo después de 24 horas está deteriorada en Nf1+/- [37, 38]. De manera crítica, no se observaron diferencias en el comportamiento agresivo en la prueba del intruso residente en los ratones machos Spred1-/-, lo que sugiere que el fenotipo de dominancia social observado no es resultado de la hiperagresión, ni tampoco hubo un fenotipo de baja ansiedad que explicara la mayor dominancia. El paradigma de la prueba del tubo mide un escenario social más complejo en comparación con la prueba de las tres cámaras. Los ratones se encuentran con múltiples congéneres por separado, desarrollando y manteniendo una relación jerárquica a lo largo del tiempo. La dominancia social aún no se ha examinado en otros modelos de ratón con RASopatía, y nuestros resultados en ratones Spred1-/- sugieren que esta prueba podría permitir la detección de fenotipos sociales en modelos en los que no se observan fenotipos de acercamiento social.


Como complemento a las alteraciones del comportamiento social en la prueba del tubo, observamos déficits en la comunicación USV en los ratones Spred1-/-. Este fenotipo surgió ya de forma neonatal, con una alteración significativa de las propiedades espectrales de las vocalizaciones. El fenotipo neonatal fue similar a los cambios observados en la producción de USV en las crías Nf1+/-, donde también se observa un tono más bajo de las llamadas USV [65]. Además, la vocalización de los adultos durante las situaciones de cortejo social se redujo significativamente en los ratones machos Spred1-/-, lo que indica que se interrumpe la comunicación específica de un comportamiento social. Estos resultados apuntan a que Spred1-/- es un modelo para los fenotipos sociales y de comunicación en el TEA y las SRAs. Junto con las alteraciones de la función cognitiva previamente reportadas [32, 36], nuestros datos indican que este modelo de ratón puede recapitular aspectos neurológicos clave del fenotipo del síndrome de Legius.


Además de las conductas sociales y comunicativas alteradas, el TEA también se caracteriza por patrones de conducta restringidos o repetitivos, o intereses restringidos [2]. No observamos ningún cambio en las conductas de excavación en los ratones Spred1-/-. Aunque las pruebas de conductas de excavación se utilizan habitualmente en la investigación preclínica del TEA para evaluar las conductas repetitivas [66], su relevancia para las conductas restrictivas y repetitivas no está clara. La caracterización del fenotipo del TEA en pacientes con NF1-ASD ha demostrado que las deficiencias más graves se encuentran en el ámbito de la cognición social [14]. Aunque se observó resistencia al cambio en los pacientes de ese estudio, no se observaron comportamientos estereotipados típicos del TEA [14]. Serán necesarios estudios más amplios sobre el TEA-NF1 para comprender mejor las diferencias del TEA-NF1 en comparación con el TEA no sindrómico. Sin embargo, la falta de un fenotipo de comportamiento repetitivo manifiesto en los ratones Spred1-/- parece encajar con un fenotipo de NF1-ASD que no presenta fuertes deficiencias en los comportamientos restringidos y repetitivos.


Hasta donde sabemos, esta es la primera demostración de que un inhibidor específico de MEK podría rescatar el comportamiento social anormal en un modelo de ratón para el TEA. El tratamiento neonatal con PD325901 en otros modelos de ratón con RASopatía ha mostrado efectos dramáticos, rescatando los defectos de crecimiento y las características craneofaciales en un modelo de ratón RafL613V [51], y revirtiendo los defectos en la morfología cerebral y el aprendizaje motor en un modelo de ratón Nf1GFAPcKO [67, 68]. Aquí mostramos que, con un tratamiento agudo en la edad adulta, se pueden normalizar los déficits de dominancia social y de construcción de nidos en Spred1-/-. Sin embargo, en un estudio separado, las deficiencias en el aprendizaje operante exhibidas por los ratones Spred1-/- no pudieron ser revertidas por un tratamiento agudo en la edad adulta con PD325901 [36]. De manera similar, en otros dos modelos de ratón para RASopatías, los ratones HRasG12V y KRasG12V, los defectos de aprendizaje y memoria tampoco pudieron ser rescatados por la inhibición de PD325901 en la edad adulta [49, 64]. Esto sugiere que los comportamientos sociales en las RASopatías pueden ser más susceptibles de modulación con la inhibición de MEK en comparación con los comportamientos cognitivos, lo que tiene implicaciones para la traducción clínica.


Nuestros datos también apuntan a un papel clave de la señalización Ras-MAPK en la regulación del comportamiento social. Muchos genes de riesgo de TEA convergen en la señalización Ras-MAPK [15], y la desregulación de la señalización ERK se observa en otras formas de TEA sindrómico [69], así como en el TEA idiopático [70], lo que sugiere que la regulación de Ras del comportamiento social también puede extrapolarse a los modelos de otras formas de TEA monogénico. Anteriormente se demostró que la sobreexpresión de Ras en las neuronas excitatorias puede alterar el comportamiento de dominancia social [71]. Aquí observamos que en la prueba del tubo para la dominancia social, la inhibición de MEK en ratones WT aumentó el comportamiento de dominancia social. Esto indica que el efecto de la inhibición de MEK no fue aditivo, sino que fue modificado por la interacción con el genotipo Spred1. Esto apunta a un escenario en el que la modulación de la señalización Ras-MAPK lejos de un equilibrio definido en cualquier dirección afecta al funcionamiento social. Este fenómeno se debe probablemente a las funciones específicas de la señalización Ras-MAPK en diferentes tipos de células neuronales que son importantes para mediar en los comportamientos sociales. Se ha demostrado que los déficits cognitivos en los modelos de ratón Nf1+/- se deben específicamente a la pérdida de Nf1 en las neuronas GABAérgicas [72], y se ha postulado que el aumento de la neurotransmisión inhibitoria en los modelos de ratón Nf1 [34] es uno de los principales mecanismos por los que surgen las deficiencias de comportamiento. Los estudios en Drosophila han demostrado que las deficiencias en el aprendizaje de la habituación se producen tanto después de manipulaciones que aumentan la actividad de Ras-MAPK en las neuronas inhibidoras GABAérgicas, como la pérdida de función de Spred1 o Nf1, como después de manipulaciones que disminuyen Ras-MAPK en las neuronas excitadoras [73]. Por lo tanto, será importante en futuros estudios determinar si existe un papel para Spred1 en la neurotransmisión GABAérgica y cómo podría regular los fenotipos de comportamiento social.


Además de la regulación de la señalización de ERK, Spred1 controla la polimerización de actina regulando la señalización de RhoA-ROCK a través de una interacción de dirección con RhoA [74, 75]. Las células madre hematopoyéticas de ratones Spred1-/- tienen una mayor polimerización de actina que depende de RhoA-ROCK, pero no de las cascadas de señalización de ERK, RAF o mTOR [74]. Aunque este mecanismo aún no se ha demostrado en las neuronas, plantea la intrigante posibilidad de que la regulación del citoesqueleto de actina por parte de Spred1 pueda estar implicada en los mecanismos de plasticidad sináptica que sustentan los fenotipos conductuales observados en los ratones Spred1-/. La regulación del citoesqueleto de actina es esencial para la formación y el mantenimiento de las espinas dendríticas, las estructuras ricas en actina que son los principales lugares de conexión sináptica. La estabilidad del citoesqueleto es fundamental para mantener los cambios sinápticos a largo plazo [76]. Además, muchos genes asociados con el TEA codifican proteínas que están implicadas en la regulación del citoesqueleto de actina [77], y la desregulación del citoesqueleto de actina se observa en los modelos de ratón Shank3 para el TEA sindrómico [78]. Un estudio anterior en ratones Spred1-/- observó déficits en la plasticidad sináptica del hipocampo, pero no hubo cambios en el número total de espinas dendríticas en las células granulares del giro dentado del hipocampo [32]. Sin embargo, esto no excluye la posibilidad de que se produzcan efectos en otras regiones del cerebro, o en la maduración y la dinámica de las espinas, por lo que se justifica la realización de más estudios.


Aunque los síntomas cognitivos y el TEA son un factor importante que afecta negativamente a la calidad de vida de los pacientes con SRAA, las opciones de tratamiento actuales para mejorar el funcionamiento cognitivo y social de los pacientes con NF1 y síndrome de Legius son insuficientes. Un objetivo principal ha sido la reducción de la sobreactivación de la señalización RAS-MAPK. El trabajo preclínico que identificó que los fármacos de estatina que reducen el colesterol podrían mejorar la cognición en modelos de ratón Nf1 mediante la modulación de la isoprenilación de Ras [53] condujo a una serie de ensayos clínicos, pero ninguno ha demostrado beneficios cognitivos significativos de las estatinas en los pacientes [79,80,81,82]. Un ensayo clínico en fase inicial que estudiaba específicamente el tratamiento con estatinas en niños con NF1 y TEA demostró su seguridad, pero no tuvo la potencia necesaria para detectar alteraciones conductuales [83]. El Ritalin se utiliza para tratar los síntomas del TDAH en niños con NF1, y ha demostrado beneficios en las medidas cognitivas y atencionales [84]. Tras la identificación del canal de potasio HCN1 como un interaccionador crítico de la NF1, se demostró que el agonista del canal HCN, Lamotrigina, rescataba los fenotipos cognitivos en ratones Nf1+/- [85]. La lamotrigina se está probando actualmente en un ensayo clínico de fase 2 para mejorar la cognición en pacientes con NF1 (NCT02256124). En un trabajo reciente en el que se comparó el perfil de TEA de las RASopatías se vio que no había diferencias significativas entre la NF1, el síndrome de Noonan y el síndrome CFC, lo que sugiere que los conocimientos de una RASopatía pueden generalizarse a otras RASopatías [4]. Esto es una prueba más del papel de la señalización RAS-MAPK en el TEA, que se ve apoyada por nuestros datos con la inhibición de MEK en este estudio.


Los inhibidores de MEK se están investigando en la clínica para el tratamiento de neurofibromas plexiformes sintomáticos e inoperables en pacientes con NF1, con el tratamiento PD325901 demostrando la reducción del neurofibroma en ensayos de fase 2 en adolescentes y adultos [56], y un ensayo de fase 2b que actualmente sigue este resultado en niños y adultos (NCT03962543). Recientemente, un inhibidor de MEK diferente, selumetinib, demostró la reducción del tumor y el beneficio clínico para los niños con reducción de neurofibromas plexiformes [86], y ahora ha recibido la aprobación de la FDA y la EMA para su uso en pacientes pediátricos con NF1. En particular, las evaluaciones cognitivas y conductuales de los pacientes inscritos en el ensayo de selumetinib están siendo seguidas como medidas de resultado secundarias [87]. Dados nuestros hallazgos que demuestran que PD325901 modula el comportamiento social en modelos de ratón, esto sugiere fuertemente que los ensayos clínicos en curso y futuros para PD325901 deben también monitorear los parámetros cognitivos y de comportamiento como resultados secundarios.



Limitaciones


Nuestro estudio tiene varias limitaciones. Como este estudio era una prueba de concepto de que la inhibición de MEK podía modular el comportamiento social en un modelo de SRA, limitamos nuestra dosis a 5 mg/kg. Esta dosis ya fue demostrada en ratones para atenuar rápidamente la fosforilación de ERK [48, 49], y para tratar con éxito otras indicaciones de RASopatía en modelos de ratón, tales como la reducción de neurofibromas plexiformes [50] y la reversión de defectos de crecimiento [51]. En el estudio en el que el PD325901 redujo los neurofibromas plexiformes en un modelo de ratón se observó una reducción efectiva del tumor tanto a la dosis utilizada en nuestro estudio, 5 mg/kg, como a una dosis menor, 1,5 mg/kg, y estas dosis fueron bien toleradas sin toxicidad [50]. Sin embargo, en ese estudio no se examinó el comportamiento. Los ensayos clínicos recientes y en curso que utilizan el PD325901 para tratar los neurofibromas plexiformes han utilizado una dosis diaria máxima de 8 mg/m2 [88], que equivale aproximadamente a 1,33 mg/kg en el ratón. Sin embargo, este curso de tratamiento ha sido optimizado para el tratamiento de tumores, y no es irrazonable esperar que un curso de tratamiento que fuera optimizado para modular el comportamiento fuera diferente. Por lo tanto, pedimos precaución con las comparaciones directas entre nuestros estudios y los ensayos clínicos en curso. Además, como parte de nuestra prueba de concepto, empleamos un paradigma de tratamiento agudo, ya que varios estudios han demostrado que los fenotipos cognitivos en modelos de RASopatía pueden revertirse con paradigmas de tratamiento agudo que comienzan 3 días antes de la prueba. La lovastatina administrada en un régimen agudo de este tipo mejoró las deficiencias de la memoria espacial tanto en ratones Nf1+/- como en ratones Ptpn11D62G/+ con síndrome de Noonan [52, 53]. Por lo tanto, antes de realizar nuevas traslaciones a la clínica, sería necesario realizar futuros estudios preclínicos de seguimiento para determinar la dosis mínima efectiva necesaria para modular el comportamiento social en modelos de ratón. Para ello, será necesario incluir estudios del curso temporal para caracterizar los efectos de los tratamientos a largo plazo con este fármaco en el comportamiento.


Nuestro estudio fenotipó a los ratones Spred1-/- en un panel de pruebas de comportamiento relacionadas con el funcionamiento social, con el objetivo de identificar fenotipos robustos y reproducibles que pudieran utilizarse para el cribado de fármacos que modulen el comportamiento en modelos de SRA. Esto incluía pruebas de sociabilidad y preferencia social, agresión y dominancia social en los ratones. Sin embargo, hay otros dominios del funcionamiento social en los ratones que no son captados por estas pruebas, como la transferencia social de información [89], o la discriminación emocional [90]. Será interesante investigar estos otros dominios sociales en futuros estudios para caracterizar mejor las deficiencias sociales del modelo de ratón Spred1-/-. Por último, el síndrome de Legius está causado por mutaciones heterocigotas en SPRED1 [16], mientras que nosotros hemos utilizado un modelo de ratón Spred1 homocigoto para poder detectar los fenotipos de forma robusta. Debe tenerse en cuenta la posibilidad de que dosis más bajas del inhibidor de MEK sean suficientes para tener un efecto en los pacientes heterocigotos.



Conclusiones


En conclusión, los fenotipos de comportamiento social pueden ser modelados de forma robusta en los ratones Spred1-/-, indicando su validez como modelo para estudiar el TEA en las SRAs. Las anomalías del comportamiento social en los ratones Spred1-/- son reversibles tras la inhibición farmacológica aguda de MEK, lo que indica un papel crítico de la señalización Ras-MAPK en la regulación del comportamiento social y un nuevo enfoque terapéutico para el síndrome de Legius.



Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a petición del autor correspondiente.



Abreviaturas


ANOVA:

Análisis de la varianza


TDAH:

Trastorno por déficit de atención e hiperactividad


TEA:

Trastorno del espectro autista


CFC:

Síndrome cardiofaciocutáneo


DMSO:

Dimetilsulfóxido


ERK:

Cinasas reguladas por señales extracelulares


EVH1:

Dominio de homología 1 de Enabled/VASP


HCN1:

Canal 1 activado por hiperpolarización de potasio/sodio y nucleótidos cíclicos


LTP:

Potenciación a largo plazo


MEK:

Proteína quinasa activada por mitógenos


mTOR:

Objetivo de la rapamicina en mamíferos


NF1:

Neurofibromatosis tipo 1


Ras-MAPK:

Ras-mitogen-activation protein kinase (proteína quinasa de activación de mitógenos)


ROCK:

Proteína quinasa asociada a Rho


RRBs:

Comportamientos restrictivos y repetitivos


SPRED1:

Dominio EVH1 relacionado con Sprouty que contiene 1


USV:

Vocalización ultrasónica


WT:

Wildtype



Referencias


Download references



Agradecimientos

No procede.


Financiación

Este trabajo fue apoyado por becas de la KU Leuven (Abriendo el Futuro) a E.L. H.B. es el beneficiario de becas postdoctorales de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO) (12C1312N y 12C1315N). S.C.B. ha recibido un premio para jóvenes investigadores de la Children's Tumor Foundation (2018-01-005).


Información del autor

Afiliaciones

Departamento de Genética Humana, KU Leuven, O&N1 Herestraat 49, Box 607, 3000, Leuven, Bélgica


Sarah C. Borrie, Ellen Plasschaert, Eric Legius y Hilde Brems


Laboratorio de Psicología Biológica, KU Leuven, Leuven, Bélgica


Zsuzsanna Callaerts-Vegh y Rudi D'Hooge


Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, Tokio, Japón


Akihiko Yoshimura


Centro de Experiencia ENCORE para Trastornos del Neurodesarrollo, Centro Médico Universitario Erasmus MC, Rotterdam, Países Bajos


Ype Elgersma y Steven A. Kushner


Departamento de Neurociencia, Centro Médico Universitario Erasmus MC, Rotterdam, Países Bajos


Ype Elgersma


Departamento de Psiquiatría, Centro Médico Universitario Erasmus MC, Rotterdam, Países Bajos


Steven A. Kushner


Contribuciones

HB y EL concibieron y supervisaron el estudio. SCB, EP, ZC-V, RD, YE, SAK, EL y HB diseñaron los experimentos. SCB, EP y HB realizaron los experimentos. SCB, EP, ZC-V y HB contribuyeron al análisis de los datos. AY contribuyó con la cepa de ratones Spred1-/-. SCB, EL y HB escribió el manuscrito con la retroalimentación de todos los coautores. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.


Autor correspondiente

Correspondencia a Hilde Brems.


Declaraciones éticas

Aprobación ética y consentimiento para participar

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Consejo de la Comisión Europea.


Consentimiento para la publicación

No procede.


Intereses concurrentes